盘点 l 2017年不容错过的Nanopore测序技术医学应用进展

发布时间:2017.12.29   浏览1141次




 

2017年火遍测序圈、刷遍朋友圈的Oxford Nanopore单分子纳米孔测序技术,凭借超长读长、无PCR过程、直接检测甲基化修饰等优势,备受国内外生物学界、医学界工作者的极大关注。目前, Nanopore测序技术不仅在生物学科研领域硕果累累,在医学科研和临床领域也得到越来越广泛的应用。

近年来,二代测序技术因其高通量、高性价比等优势为遗传病的临床研究及诊断带来了前所未有的革命性改变,大大提高了遗传病致病基因检测的效率和准确性,使人类对自身基因功能有了更多更深入的认识。但由于二代测序读长太短且受基因组重复序列、GC含量高等影响,只能满足部分遗传病基因检测的需求,对多样性和复杂性疾病致病原因的检出率有限。Nanopore测序技术读长可高达1Mb,能够很好的检测基因组结构变异(Structural Variations,  SVs)、点突变等各种致病原因,从而很好的解决了二代等测序技术在遗传病基因检测方面的瓶颈。

 

目前,越来越多的科研及临床工作者致力于将Nanopore测序技术应用到遗传病基因检测。例如,Roeck等[1]分别用二代和Nanopore测序技术检测了大量阿尔茨海默病患者ABCA7 基因的提前终止密码子(Premature Termination Codon, PTC)突变情况,结果发现Nanopore测序比二代测序多检测出7个PTC突变,造成了不同程度无义介导的mRNA降解和转录调控,影响ABCA7基因的表达,进而影响疾病的严重程度,这一发现可能为阿尔茨海默病的干预性治疗创造机会。

 

 

此外,Roosmalen等[2]利用Nanopore测序技术检测病人染色体碎裂重排病,结果显示Nanopore测序与Illumina测序相比准确性更高,在结构变异检测应用中更胜一筹。

 

 

Nanopore测序技术凭借超长读长、无PCR过程、直接检测甲基化等优势,可以快速、准确的检测肿瘤中的SVs、点突变、甲基化修饰等,在肺癌[3]、脑胶质瘤[4]、结直肠癌[5]等基因检测方面具有重要意义。例如,Alexis等[6]凭借Nanopore测序的超长读长,检测了导致胰腺癌CDKN2A / p16SMAD4 / DPC4肿瘤抑制基因失活的SVs,包括大片段的插入、缺失、倒位、易位等。

 

在2017年Nanopore科研团体大会上,来自新泽西州罗格斯癌症研究所的Jeffrey Rosenfeld 展示了利用长读长测序技术对肿瘤DNA进行表征的数据。在乳腺癌中,HER2扩增子扮演着重要的角色,而这一角色或许尚未得到完整的认识。目前已知HER2扩增子的基因拷贝数呈增加趋势,但这些经过复制和潜在重排的基因具体的组织方式很难利用传统的短读长技术表征。因此,通过 Nanopore长读长测序技术,可以很好的解决传统测序技术不能解决的难题。

 

Oxford Nanopore Technologies公司基因组应用主管Sissel Juul在2017年Nanopore科研团体大会上,介绍了团队用Oxford Nanopore的MinION测序仪,通过进行胚胎植入前遗传学筛查(Preimplantation Genetic Screening, PGS),检测染色体数目畸变及增加的潜在流产风险。

 

CReATe 生殖医学中心的Svetlana Madjunkova在会上展示了Nanopore测序技术在胚胎植入前基因诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)中潜在可用性的评估数据,并介绍了该团队采用基于MinION测序仪开展PGD的测序流程和生物信息学流程,精确地在5对夫妇中携带者的基因中确定了平衡易位的基因断裂点。基于测序数据,每一个基因易位的基因断裂点PCR检测都可以被定制,从而实现了对21个来自这些夫妇的胚胎进行高灵敏度检测。他表示, Nanopore长读长测序技术是一个新兴的解决方案,为针对包括平衡易位携带者在内的染色体重排的高分辨率临床植入前基因诊断提供助力。

 

2017年,用纳米孔测序已经完成了细菌,真菌和病毒基因组的检测。MinION测序仪凭借超长读长、快速准确、便携性等特点让实时测序能上至太空、下达深海,大到煤矿、冰川、热带雨林,小至厨房、学校、疫情观察站,不仅可以探索更多未知物种,更能使传染病和抗生素耐药的检测与分析一体化方案成为可能,目前已有大量的临床案例,如早产儿病原微生物耐药检测[7]、英国抗生素耐药基因检测[8]、尿样中细菌病原体的鉴定[9]等。

 

在2017年Nanopore科研团体大会上,Loman教授介绍了他的团队2013年到2016年间在西非地区对埃博拉疫情进行追踪研究的工作。2015年他的团队在几内亚利用MinION开展研究项目,快速洞悉病毒传播,从而促进了疫情爆发管理工作的水平。 MinION可以被装在一个小型的行李箱里进行运输并在现场简易安装运行,在短短几天内得出实时数据结果。通过纳米孔测序得出的数据,该团队发现埃博拉病毒常常在一个国家内部或国与国之间远距离传播。该团队进一步发现,新的埃博拉病毒可以通过之前感染后存活的宿主迅速传播造成爆发,而不是之前认为的通过动物群体。其中一个例子是,自初次感染500天后,埃博拉病毒经由一个感染存活宿主得到传播,引起了新一轮的感染数猛增。

 

人类白细胞抗原(Human leukocyte Antigen, HLA)系统是人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)的别称,位于基因组中与免疫最相关的区域,是目前为止人类最复杂的遗传系统之一,具有调节免疫应答等功能。在医学上,匹配上正确的HLA型别对骨髓移植和器官移植能否成功起到决定性作用,且研究发现许多疾病(如强直性脊椎炎、糖尿病)与HLA基因的型别相关。Chang等[10]的实验数据显示,纳米孔2D读数和1D读数都能够对HLA进行精确分型。目前通过短读长测序是无法直接给出等位基因的分型信息,而纳米孔测序的长读长可以突破这一技术瓶颈,准确进行HLA基因分型,因此Oxford Nanopore在HLA分型中前景光明。

 

参考文献:

[1] Roeck et . al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2017 Sep;134(3):475-487.

[2] MJ van Roosmalen, MC Stancu, I Renkens, et al. MappingAnd Phasing Of Structural Variation In Patient Genomes Using NanoporeSequencing[J]. Nature Communications, 2017. doi: 10.1038/s41467-017-01343-4.

[3] Suzuki et . al. Sequencing and phasing cancer mutations in lung cancers using a long-read portable sequencer. DNA Res. 2017 Dec 1;24(6):585-596.

[4] Euskirchen et . al. Same-day genomic and epigenomic diagnosis of brain tumors using real-time nanopore sequencing. Acta Neuropathol. 2017 Nov;134(5):691-703. 

[5] Pradhan et . al. Detection of subclonal L1 transductions in colorectal cancer by long-distance inverse-PCR and Nanopore sequencing. Sci Rep. 2017 Nov 6;7(1):14521.

[6] Norris et . al. Nanopore sequencing detects structural variants in cancer. Cancer Biol Ther. 2016;17(3):246-53.

[7] Richard M. Leggett et . al. Rapid MinION metagenomic profiling of the preterm infant gut microbiota to aid in pathogen diagnostics. BioRxiv preprint first posted online Aug. 24, 2017.  Doi: http://dx.doi.org/10.1101/180406

[8] Ludden et . al. Sharing of carbapenemase-encoding plasmids between Enterobacteriaceae in UK sewage uncovered by MinION sequencing. Microb Genom. 2017 Jul 4;3(7):e000114.

[9] Schmidt et . al. Identification of bacterial pathogens and antimicrobial resistance directly from clinical urines by nanopore-based metagenomic sequencing. J Antimicrob Chemother. 2017 Jan;72(1):104-114.

[10] Chang et . al. Accurate typing of class I human leukocyte antigen by Oxford nanopore sequencing. BioRxiv preprint first posted online Aug. 20, 2017; doi: http://dx.doi.org/10.1101/178590.