推荐策略
样本要求:常规动植物样本,样本DNA总量≥10 μg,样本浓度≥100 ng/µl
测序方式:非PCR扩增建库,Nanopore测序
建议测序量:不少于30X数据
分析内容
- 参考序列比对分析
- 不同类别碱基修饰位点检测
- 碱基修饰程度分析
- 碱基修饰位点上下文motif分析
- 碱基修饰基因功能分析
结果展示
1、不同类别碱基修饰位点检测
通过软件比对,进行甲基化位点分析,获得样本中可靠的甲基化修饰信息。
5mC位点检测
6mA位点检测
2、甲基化差异位点鉴定
不同样本之间,甲基化修饰水平具有显著差异的基因组区域一定程度上体现了样品间调控上的差异。利用这些差异位点所在的基因组位置与基因组结构注释信息,可以对其进行结构注释。
差异位点结构注释
3、差异性甲基化区域相关基因富集分析
3.1GO富集分析
Gene Ontology(简称GO)是一个国际标准化的基因功能分类体系,能全面描述生物体中基因和基因产物的属性。对差异性甲基化区域相关基因做GO富集分析,可以挖掘甲基化调控基因相关的生物学功能,细胞组成,生物学过程。
3.2KEGG富集分析
KEGG代谢通路数据库涵盖了各个物种的生化代谢路径和信号转导路径。通过KEGG显著性富集能确定差异性甲基化区域相关基因参与的主要生化代谢途径和信号转导途径。
案例解析
案例分析
案例解析
PacBio三代测序技术获得拟南芥全基因组6mA修饰图谱
该成果是国内首篇基于PacBio单分子测序技术进行真核生物6mA修饰的研究,揭示了拟南芥中6mA修饰的发生规律,并为研究陆生植物碱基修饰的分布模式和潜在功能提供基础。武汉未来组凭借丰富的三代测序项目经验为该项目提供PacBio测序服务并参与分析。
DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在调控基因组印记、X染色体失活、转座子沉默、基因表达、表观遗传记忆、胚胎发育和肿瘤发生等方面发挥着重要作用。
研究概述
研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平,后续选择D9和D21的样本进行三代PacBio SMRT全基因组测序,比较两个时期拟南芥6mA修饰的分布模型和动态变化,并结合转录组信息更深入地研究6mA潜在功能。
研究结果
1、6mA修饰在拟南芥基因组内广泛存在
研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平,发现在这些样本中都广泛存在不同程度的6mA,其水平随着个体发育的进程逐渐增加,在D21出现了急剧上升。
Dot blot方法检测拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平
2、使用PacBio SMRT测序获得拟南芥全基因组6mA图谱
以D9样本示例,PacBio SMRT测序深度经计算为103×,高于PB官方推荐的测全基因组甲基化的要求100×。通过测序时两个脉冲荧光信号之间的间隔时间评估该位点的甲基化程度,最终获得了链特异性的D9全基因组6mA信息。实验结果表明,在包含线粒体、叶绿体和核基因组中所有的29,811个腺嘌呤中,发生6mA碱基修饰的比例为0.04%,与LC-MS/MS实验中评估的0.048%吻合,并且发现在越靠近着丝粒区域表现出越高的6mA丰度和轻微降低的平均甲基化水平。
D9 和D21 拟南芥全基因组6mA图谱
3、6mA分布模式解析
通过评估6mA在基因组内不同的区域(Exon、Intron、5’UTR、3’UTR区,Fig.5A)和位处基因的不同类型(Protein coding、miRNA、snoRNA等,下图 B、C)分析6mA的分布模型得知:与基因间区相比,6mA在 gene body区更丰富。
拟南芥中6mA分布模式(D9)
4、在拟南芥发育过程中,6mA修饰是动态的
通过比较D9和D21拟南芥全基因组6mA分布图谱、overlap关系、分布模式的区别,得知在拟南芥发育过程中,6mA修饰是动态变化的,在位点、程度上都有明显的区别。
拟南芥中6mA分布模式(D21)
5、6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联
通过将6mA修饰位点及程度与来自RNA-seq的基因表达信息结合分析,结果表明6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联。高表达基因的TSS上下游2.5kb区域内有更多的6mA修饰位点,高表达的基因有更多的6mA修饰位点,被6mA修饰的基因比未修饰的基因表达水平显著增高,并且靠近TSS时,差异更明显。
6mA修饰与RNA数据关联分析
参考文献
Liang, Z. et al. DNA N6-Adenine Methylation in Arabidopsis thaliana. Developmental Cell, 2018.