产品优势
目前,有很多物种尚未获得完整的基因组信息,甚至没有被发掘到,尤其是难培养的微生物!而基于长读长序列的宏基因组测序,可以组装获得更完整的基因组,甚至单contig级的基因组,直接绕过培养,获取基因组信息,大大减少了科研工作量,降低了新种发掘难度。
1.直观反映群落组成和群落功能
2.更完整的基因组、更完整的基因
3.高丰度菌株基因组完成图
4.完美追踪抗性基因与宿主关联信息
方案策略
Nanopore测序方案
测序平台 | 测序策略 | 承诺指标 | 交付周期 |
Oxford PromethION | 1D文库 常规样本:1cell(≥50Gb) 复杂样本:内部评估 | 常规样本:丰度≥10%且序列支持深度≥70X,承诺一半可以组装获得单contig级别基因组。 复杂样本:内部评估。 | 建库测序:12个工作日 标准分析:15个工作日 高级分析:根据实际的信息分析内容而定。 |
Illumina/MGI | 500bp 打断Meta文库 常规样本:50Gb 复杂样本:内部评估 |
PacBio测序方案
测序平台 | 测序策略 | 承诺指标 | 交付周期 |
PacBio Sequel | 构建2Kb或5Kb插入片段文库,CCS测序 常规样本:1-2cell 复杂样本:内部评估 | 常规样本:丰度≥10%且序列支持深度≥70X,承诺一半可以组装获得单contig级别基因组。 复杂样本:内部评估。 | 建库测序:18个工作日 标准分析:15个工作日 高级分析:根据实际的信息分析内容而定。 |
分析内容
标准分析
- 物种注释
- 宏基因组组装
- 宏基因组分箱
- 宏基因基因结构和功能注释
- 高完整度基因组圈图
高级分析
- 物种与功能组成分析
- 物种与功能差异分析
- 样本间比较分析
结果展示
1.物种注释
物种注释可视化展示
2.宏基因组的组装及结果统计
基因组的contig长度累计图
宏基因组分箱
分箱物种分布树图
宏基因基因结构和功能注释
基因组编码蛋白eggNOG、KEGG和CAZy功能分类统计
高完整度基因组圈图
部分物种基因组圈图。由外到内依次为编码基因(正义链)、编码基因(负义链)、tRNA(橙色)和rRNA(紫色)、CRISPR(蓝色)和基因岛(绿色)、GC比、GC-skew、测序深度。
常见问题
1. 如何选择Nanopore和PacBio平台进行宏基因组测序?
PacBio平台CCS模式原始测序碱基准确度较高,可不用二代测序数据校正,但是其测序读长偏短,有效reads数偏少,测序周期较长,相对成本偏高。Nanopore平台测序读长更长,可跨过复杂及重复序列区域,同产量下有效reads数更高,测序周期更短,相对成本更低。但是其原始测序碱基准确度需要经过二代测序数据校正,校正后可达Q40水平。客户可结合这两个平台的特点及研究需要选择。
案例解析
案例分析一
案例解析
案例1 奶牛瘤胃宏基因组组装的4,941个基因组
发表在Nature Biotechnology的最新瘤胃参考基因组集就用到了Oxford Nanopore Technologies,并与Illumina进行了比较。首先,作者使用MinION便携测序仪产生了11.4G的数据,数据N50超过11Kbp,平均长度超过6Kbp。接下来作者使用Canu软件进行宏基因组组装,获得了178Mb大小的基因组 (图1 b),最长的Contig达到3.8Mb (图1 c),N50长度268Kbp (图1 a)。其中包含31个直接成环的contigs,这些contigs代表了质粒甚至细菌染色体。
illumina和nanopore宏基因组组装统计比较。
最令人兴奋的是,作者利用纳米孔测序,直接从组装结果中获得了3个完整的细菌基因组,即1条contigs代表一株菌!通过评估发现,这3条contigs无论是基因组大小、完整度评估,还是污染度评估,都属于高质量的MAGs。通过与最相似的Illumina组装结果进行比较发现,tig00000032和tig00000052都有着极佳的共线性,然而对于tig00000085,Illumina的结果丢失了部分组装信息。进一步说明了,在基因组组装完整度上,ONT的结果要优于Illumina,可以说达到了近乎完美的程度(图2)。
nRUG14950与RUG14032全基因组比对
参考文献:
Stewart R D, Auffret M D, Warr A, et al. Compendium of 4,941 rumen metagenome-assembled genomes for rumen microbiome biology and enzyme discovery[J]. Nature biotechnology,2019,37(8):953.
案例2 PacBio CCS reads解析环境微生物宏表观基因组
来自东京大学的Satoshi Hiraoka等人使用PacBio CCS技术对日本最大的淡水湖——琵琶湖微生物群落进行了宏基因组和宏表观基因组的研究。采集不同深度水样,对测得的CCS reads进行分类,其中,>88%鉴定到门,>56%鉴定到属,高于同样计算方法的基于Illumina测序的鸟枪法宏基因组。研究从浅、深水中分别组装出554和345条contigs,对应的N50为83kb和76kb,其中,分别有52.3%和29% contigs分配到15个和4个bins上,每个bin获得一个基因组草图,基因组完整性在17%-99%之间。
从草图基因组中检测出22种候选甲基化motifs,其中9种首次发现,暗示环境原核生物DNA甲基化体系中还存在着诸多没有被挖掘的多样性,包括一些没有培养过的菌株。此外,研究者还通过计算预测和实验验证了与甲基化motifs相关的4种甲基转移酶(MTases),其中2种被发现能够识别新的motif序列。
CCS reads让宏基因组组装、binning和基于序列的蛋白分类都更容易,更重要的是,该方法揭示了多个新的motif,表明基于CCS reads的宏基因组作为一种强大的方法可用于鉴定自然界中未探索的多种原核DNA甲基化系统。
组装contigs的基因组binning(一个圆圈表示1条contig,颜色和大小代表所属的bin和序列大小)
参考文献:
HIRAOKA, Satoshi, et al. Metaepigenomic analysis reveals the unexplored diversity of DNA methylation in an environmental prokaryotic community. Nature communications, 2019, 10.1: 159.