方案策略
测序平台 | 测序策略 | 参考指标 | 交付周期 |
Nanopore PromethION | 1D文库 ≥100×测序深度 | 完成图(无N碱基,无gap) 单碱基错误率<0.01% | 建库测序:10个工作日 标准分析:5个工作日 高级分析:根据实际信息分析内容而定 |
PacBio Sequel | 20kb SMRTbell文库 CLR测序 ≥100×测序深度 | 完成图(无N碱基,无gap) 单碱基错误率<0.01% | 建库测序:16个工作日 标准分析:7个工作日 高级分析:根据实际信息分析内容而定 |
备注:对于以下较复杂的情况不能在上述策略中保证完成图,或需要修改方案:
- 基因组大小>7M,
- 样品不纯(包括但不限于其它物种序列污染),
- 染色体基因组个数+质粒个数>4,
- 转座子或其它重复序列在基因组中的比例异常高(>10%),
- 最长重复序列大于9K。
分析内容
标准分析
- 数据产出及质控
- 基因组组装及评估
- 基因结构预测
- 基因功能注释
- 基因组圈图
高级分析
1.比较基因组分析(基因家族,共线性,进化树)
2.基因岛(Genome Island) 预测
3.前噬菌体(Prophage)预测
4.次级代谢基因簇分析
5.PHI数据库注释
6.CAZy数据库注释
7.分泌系统蛋白及T3SS效应蛋白预测
8.细菌病原体的毒力因子(VFDB)注释
9.耐药基因(ARDB)注释
结果展示
基因组组装
Nanopore长读长测序克服基因组中重复区域和高GC区域组装难题,获得单条Contig,无N 碱基,无gap的细菌基因组完成图。
Genome size (bp) | Contig Number | Contig N50 (bp) | Longest contig (bp) | Shortest contig (bp) |
7,397,269 | 1 | 7,397,269 | 7,397,269 | 7,397,269 |
基因组功能注释
利用COG、KEGG、GO、等数据库对6186个编码蛋白进行功能注释,并分类统计。
基因组编码蛋白COG、KEGG、GO功能分类统计
基因组圈图
将基因组测序深度、GC分布、GC-skew以及基因组结构注释进行整合,绘制核基因组圈图。
细菌核基因组圈图
常见问题
- 三代细菌基因组测序相对二代有哪些显著优势?
二代测序技术由于读长较短及碱基偏好性问题,难以解决基因组中重复区域及GC异常区域,三代测序平台,由于读长较长,不需要经过PCR扩增,可以一次性获得完整的细菌基因组图谱,实现没有gap和N碱基的组装,同时还可以获得质粒基因组信息。
- contig成环,完成图,圈图分别指什么?
contig成环:是通过组装矫正后基因组的contig是否存在overlap判断;如果存在overlap,那么contig成环(交付的结果是去除overlap的)。
完成图:是指基因组组装完整,通常是所有的contig(不算质粒,部分菌有多个染色体)均成环;但有一些菌(放线菌)的基因组不是环状的,那么有没有组装成完成图,主要是通过contig两端是否存在反向重复序列(20kb左右)来判断。
圈图:是基因组的一种展示结果。
案例解析
案例分析
案例解析
Nanopore测序助力发现替加环素耐药基因
研究背景
细菌耐药性一直是微生物研究的重点领域,肠杆菌科细菌耐药性的出现和蔓延对人类和动物的健康构成了严重威胁。碳青霉烯类药物、黏菌素和替加环素被认为对多重耐药的革兰氏阴性细菌有效,然而随着碳青霉烯类药物和黏菌素耐药性的爆发,替加环素成为治疗多重耐药细菌感染的最后一道防线。
替加环素的耐药性不可避免的出现,四环素破坏酶Tet(X)具有一种独特的酶促四环素失活机制,研究已证实Tet(X)在体外对包括替加环素在内的所有四环素有降解活性,然而其分布、遗传结构和临床意义仍有待探索。在本研究中,作者描述了一个质粒介导的可移动替加环素耐药基因tet(X4),并探讨了tet(X4)阳性大肠杆菌在中国人群、食用家禽家畜及其周边环境中的流行情况(图1)。
图1 中国tet(X4)样品抽样区域图
主要结果
1、tet(X4)特征研究
研究者2017年从猪粪中分离到一株具有替加环素耐药性的大肠杆菌菌株LHM10-1,全基因组测序结果表明LHM10-1的序列类型属于ST515,包含一条4.81Mb的染色体和6个质粒。其中在pLHM10-1-p6质粒上发现了一个全长1158 bp 编码385个氨基酸(图2a)的tet(X)-like基因,命名为tet(X4)。基因克隆实验、平板扩散分析以及四环素降解实验均证明Tet(X4)蛋白能够对整个四环素家族产生耐受性(图2b,c,d)。体内实验表明tet(X4)阴性菌株感染小鼠对替加环素处理高度敏感,而替加环素对tet(X4)阳性菌株感染的小鼠治疗24小时后无明显影响(图2e),由此推测,tet(X4)基因的存在可能是导致替加环素治疗失败的原因之一。
图2 Tet(X4)在体内外对四环素的作用
2、pLHM10-1-p6质粒特征分析
对包含tet(X4)序列的质粒pLHM10-1-p6分析表明,该质粒属于宽宿主范围的IncQ1类质粒,与其他IncQ1质粒比较,它们共享类似的序列区域(图3)。进一步实验发现,可以将替加环素耐药性从大肠杆菌LHM10-1转移到多种实验室菌株中;连续220世代无抗生素培养后,pLHM10-1-p6质粒仍然在不同菌株中稳定存在,表明tet(X4)具有很高的可转移性和稳定性。这也使得质粒pLHM10-1-p6在临床耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)菌株上也表现出良好的转入能力,这些结果暗示:质粒介导的可移动的替加环素耐药基因tet(X4)有可能产生真正的泛耐药菌株,从而导致感染无药可治。
图3 携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6质粒特征
3、tet(X4)阳性菌株的流行情况
本研究从4,189个不同地区和来源的样本中共检测到42个菌株携带tet(X4)基因,这些阳性大肠杆菌分离株在中国东部和南部5个省均有发现(图1)。药敏试验表明,42个tet(X4)阳性菌株全部具有对替加环素、四环素、磺胺甲恶唑-三甲氧苄啶和氟苯尼考的耐药性。质粒分析发现57.1%(24/42)的tet(X4)阳性菌株含有相同的IncQ1类型的pLHM10-1-p6-like质粒。在自传播辅助质粒存在下,IncQ1类型质粒能够转移到广泛的细菌宿主中。携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6-like质粒在转移的过程中,常见的携带mcr-1(一种粘菌素抗性基因)的质粒可以作为其辅助质粒,这进一步促进了替加环素耐药性的传播。