Iso-Seq全长转录组

案例解析

PacBio长读长测序揭示玉米转录组的复杂性

研究背景

玉米（Zea mays）是全球重要的农作物，也是研究植物转录组代谢通路的遗传模型。玉米基因组序列于2009年公布，后续利用EST和RNA-Seq转录组数据对其基因注释进行了补充。然而RNA-Seq中，短读长无法提供转录本全长序列，限制了可变剪接形式的界定，同时，短读长拼接会得到低质量的转录本，导致错误的基因注释。

冷泉港实验室等单位利用PacBio长读长测序技术，对玉米6个组织进行了全长转录组测序分析，在已有的玉米B73 RefGen_v3上发现了大量新信息，揭示了玉米基因表达的复杂性，研究成果发表在Nature子刊。

研究方法

1. 取玉米自交系B73不同发育阶段的6个组织（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA, 反转录过程中加组织特异性barcodes，按照等摩尔比值cDNA平均混合，构建6种插入片段文库（<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb)，不同的文库加上序列特异性的barcode，上机46个SMRT Cell进行全长转录组测序。
2. 对6个组织进行二代RNA-Seq测序，每个样品三个重复。
3. 通过已发表的甲基化数据，对isoform，IncRNA和non-IncRNA进行甲基化分析。

研究结果

1. 下机得到了3,716,604 reads，过滤得到接近一半的全长转录本序列（1,553,692，42%）。再处理得到643,330个高质量的转录本序列，其中606,145个序列（2%）能够比对到玉米RefGen_v3参考基因组上。 经聚类得到了111,151个isoform，对应26943个基因，涵盖了玉米RefGen_v3基因注释的70%。其中57% isoform来自已知基因位点的新isoform；2,803 (3%) 新isoform来自2,253 新位点。

2. 已有研究中有1704个高度可信的LncRNA（平均长度为463bp）。本次分析得到了878个LncRNA，其中11个是已有研究确定的， 另外867个是新发现的LncRNA（平均读长为1kb）。

新发现和已确定lncRNAs长度对比

3. 将PacBio isoforms与 Illumina短读长组装的isoform分析结果进行了比较，其中短读长数据运用两种分析方法（Cufflinks和Trinity）进行对isoform进行组装，能鉴定到PacBio的isoform分别仅为22%和8%，表明转录组短读长分析方法在检测isoform的局限性，而PacBio长读长能得到精确的isoform，尤其是在一个基因对应几种isoform的复杂情况下优势明显。

PacBio的isoform对短读长组装构建的isoform评估

参考文献

Bo Wang et al., (2016). Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. NATURE COMMUNICATIONS.