重大突破| 三代测序助力人类基因组DNA 6mA甲基化研究

近日,中山大学中山眼科中心肖传乐教授、广州医科大学附属第三医院晏光荣教授、中国农业科学院生物技术研究所谷晓峰研究员、北京放射医学研究所伯晓晨研究员、美国费城儿童医院&北京希望组首席科学家王凯教授等学者与北京希望组余国亮带领的团队共同合作完成的文章“N6-Methyladenine DNA Modification in Human Genome”在 Molecular Cell杂志在线发表。该研究利用三代测序技术,首次获得了中国人DNA  N6-甲基腺嘌呤(6mA)修饰图谱,是人类基因组DNA甲基化研究领域的重大突破。

DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在调控基因组印记、X染色体失活、转座子沉默、基因表达、表观遗传记忆、胚胎发育和肿瘤发生等方面发挥着重要作用。真核生物中,5mC是最常见的甲基化修饰,而在原核生物中,6mA是最常见的甲基化修饰,且6mA甲基化在限制-修饰(R-M)系统的调控、DNA错配修复、基因表达等方面发挥了重要的作用。在早期的研究中,受技术条件的限制,并没有在真核生物中检测到DNA 6mA修饰,因此过去认为DNA 6mA在包括人类在内的真核生物中不存在。近年来,随着测序技术的不断发展,已经在莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫、 果蝇 、真菌等真核生物中发现了DNA 6mA的存在,并且发现6mA甲基化参与了调控基因和转座子的表达。此外,已有大量研究表明RNA m6A修饰在人类mRNA中广泛存在,与RNA剪接、mRNA稳定性和基因表达有关。但有关DNA 6mA修饰是否广泛存在于人类基因组中,以及是否在基因调控和疾病致病机制中发挥作用等问题仍未得到深入研究。

近年来以PacBio SMRT和Oxford Nanopore 为代表的三代测序技术将高通量和长读长相结合,同时具有高效、单碱基分辨率的优势,无需额外的样本制备,可直接获得整个基因组范围内的区域甲基化信息,为评估人类基因组中的甲基化提供了一个有效的方案。

本研究首先对第一个基于三代测序的亚洲人参考基因组“华夏一号”的PacBio SMRT测序数据进行分析,共发现881,240个 6mA 修饰位点,首次获得了中国人DNA  N6-甲基腺嘌呤(6mA)修饰图谱。通过分析该甲基化图谱的特征,发现DNA 6mA在常染色体上的丰度较高,在X染色体和Y染色体中的丰度相对较低,且这些位点主要富集在外显子编码区。

各染色体上DNA 6mA的丰度分布

DNA 6mA在染色体各区域上的丰度分布

RNA 6mA已被证实对基因表达有重要的影响,但DNA 6mA在基因表达方面的潜在作用在很大程度上仍不清楚。本研究发现,高表达水平基因的外显子区域具有较高的6mA丰度,且进一步分析发现外显子区域的6mA丰度与RNA表达水平正相关。此外,通过对DNA 6mA丰度高的基因进行了GO富集分析发现,6mA修饰位点在G 蛋白偶联受体(GPCR)相关基因中有显著的富集。GPCRs作为膜蛋白受体参与多个细胞信号转导过程,以改变细胞的状态,且与许多疾病的发生有关,也是约40%治疗性药物的通用靶点。因此,6mA甲基化可能在GPCR相关基因表达调控中发挥重要作用,但还需进一步的研究。

m6A丰度与RNA表达水平的关系及其位置分布

此外,本研究发现和证实了DNA 6mA由N6AMT1甲基化转移酶和ALKBH1去甲基化酶调控。为了研究DNA 6mA的功能,该研究还分析了肿瘤组织及非肿瘤组织的6mA水平。结果发现,与非肿瘤组织相比,肿瘤组织中6mA及其甲基转移酶N6AMT1的水平呈现下调,而去甲基化酶ALKBH1的水平呈现上调。为了进一步研究DNA 6mA修饰对肿瘤发生的影响,对癌细胞中N6AMT1和ALKBH1进行过表达和沉默。结果发现沉默N6AMT1基因降低了癌细胞基因组的DNA 6mA水平,促进了癌细胞的生长,而N6AMT1过表达则以剂量依赖性方式抑制了癌细胞生长。沉默ALKBH1基因则增加了癌细胞基因组DNA 6mA水平,抑制了癌细胞的生长,而ALKBH1过表达以剂量依赖的方式逆转了这些效应。此外,通过构建肺癌异种移植小鼠模型,也得到与上述一致的结论。因此,结果表明DNA 6mA修饰水平的降低可以促进肿瘤发生。

N6AMT1下调对细胞增殖,迁移能力和肿瘤大小的影响

ALKBH1下调对细胞增殖,迁移能力和肿瘤大小的影响

综上所述,本研究首次获得了中国人DNA  N6-甲基腺嘌呤(6mA)修饰图谱,揭示了DNA 6mA甲基化修饰在人类基因组中的调控机制,加深了人们对于DNA 6mA甲基化生物学功能的认识。

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