未来组项目文章||纳米孔测序技术揭示染色质调控基因表达的基础

2019年6月14日，美国俄亥俄州立大学的区健辉（Kin Fai Au）博士团队在Genome Research（IF=9.944）杂志在线发表题为“Single-molecule long-read sequencing reveals the chromatin basis of gene expression”的研究论文，该研究提出一种新的实验方法MeSMLR-seq（methyltransferase treatment followed by single-molecule long-read sequencing）外源甲基转移酶处理后进行纳米孔测序，从而实现在单个核苷酸分子水平进行核小体和染色质状态的长距离测定。区健辉课题组的王运浩博士和王安琪博士为共同第一作者，武汉未来组承担了其中的ONT建库、测序工作。

在真核生物中，细胞面临遗传信息存储和包装问题。DNA作为遗传信息的载体，通过缠绕组蛋白八聚体（H2A, H2B, H3和H4）形成染色质的基本单元——核小体。核小体由”linker DNA”连接伸长，核小体的动态包装导致两种不同的染色质状态：“开放”（具有稀疏核小体的可访问和活跃基因组区域）和“闭合”（具有致密核小体的不可访问和不活跃基因组区域）。核小体的配置和染色质开放状态的动态变化在转录、DNA复制和修复中起重要的调节作用。

基于第二代“短读长”测序技术或单细胞测序技术的方法可以在群体或单细胞水平检测核小体配置和染色质开放状态，但是无法提供复杂的长距离核小体配置和染色质开放状态的异质性信息。牛津纳米孔测序技术（Oxford Nanopore Technologies，ONT），利用碱基穿越纳米孔时产生的原始电信号信息在单分子水平检测DNA修饰，无需PCR扩增和亚硫酸氢盐转化，并且极大地增加了测序的长度。因此，ONT测序read可以覆盖多个核小体的组合和跨越多个基因组元素的不同染色质状态。

本研究利用ONT测序的长read序列和丰富的单碱基原始信息，开发了MeSMLR-seq方法（图2）和相应的生物信息学工具NP-SMLR，来研究长距离核小体配置和染色质开放状态的异质性及动态变化。

图2 MeSMLR-seq 流程

研究者首先对酵母基因组中的核小体配置进行单个DNA分子水平的检测和定相，在不同核小体覆盖度下的检测均能达到80%准确度，表明了MeSMLR-seq对核小体单分子远程比对的准确性和稳健性（图3）。在单细胞水平检测发现，单个MeSMLR-seq读数跨越长距离范围，可以测定多个核小体（中位数为37），因此，MeSMLR-seq可捕获DNA分子中核小体占有率的动态性和异质性。

图3 利用MeSMLR-seq数据进行5mC检测和核小体占有率检测

转录起始位点在转录调控中有重要作用，MeSMLR-seq揭示了其周围沉默基因和活跃基因的差异核小体组织原则。对于转录沉默的基因，在一个细胞群体中核小体配置具有更大的异质性；而对于转录激活的基因，核小体的间距分布具有更高的一致性（图4）。

进一步研究表明基因表达与染色质开放状态之间呈正相关关系，随后进行了单分子染色质开放状态长距离比对性能的评价，结果表明MeSMLR-seq能够分析相邻基因的偶联染色质状态，检测细胞群中染色质状态的异质性。最后，对两个相邻的葡萄糖转运蛋白基因的染色质偶联状态变化研究表明，Open-HXT3与Closed-HXT6耦合模式的细胞亚群比例随葡萄糖浓度降低而降低，而Closed-HXT3 and Open-HXT6耦合模式的则相反（图5）。

图5 HXT6和HXT3基因的染色质开放状态与共表达之间的“偶联”关系

综上所述，本研究提出的一种新的实验方法MeSMLR-seq，实现了在长距离-单个核苷酸分子水平进行核小体和染色质状态测定，为基因表达的染色质调控研究提供了一个有力工具。本研究利用MeSMLR-seq的独特输出，对转录起始位点周围核小体的组织规则以及组合的异质性进行了研究。最后利用多个基因组区域的染色质状态与单细胞RNA-seq数据一起，定量研究了染色质开放状态与基因转录之间的关系，揭示了转录重编程过程中相邻基因的染色质偶联变化。