一滴蚊子血克隆出恐龙太扯？嗯，克隆出这只蚊子没毛病！
HMW DNA提取：
在200μl PBS中捣碎虫体，使用Qiagen MagAttract HMW kit (PN-67653)试剂盒提取基因组DNA，并作如下调整：将Buffer ATL替换为200ul 1X PBS；在组织匀浆和孵育之前将PBS与RNAse A、蛋白酶K、Buffer AL混合；孵育时间缩短至2h；轻击管壁混匀；清洗1min；提取过程中转移DNA均使用宽口tips；
这些调整与10×genomics基因组提取方法一致，目的在于获取>50Kb的基因组DNA分子。结果显示，通过此法获得的gDNA总量约为250ng,且DNA长度主要分布在~150Kb左右。但经过低温运输过程之后，部分gDNA发生降解（Fig.1）；使用Qubit fluorometer检测DNA浓度，随后使用其中的100ng DNA进行文库构建。
文库构建：
①首先使用0.45X AMPure②随后使用0.80X AMPure；
Fig.1 Anopheles coluzzii gDNA及最终文库
SMRT测序：
测序引物版本v4.0；聚合酶v3.0；使用Sequel系统测序，测序试剂版本v3.0，运行时间1200min；软件版本v6.0；共测序3 个SMRT Cells。
数据产出：平均25 Gb /SMRT Cell (20 h movies)
组装指标：使用FALCON-Unzip软件进行de novo组装，contig N50 3.5 Mb，基因完整度大于98%
- 基因组提取过程轻柔操作，保留大片段高质量DNA；
- 建库过程不经历DNA剪切及片段筛选过程，避免剪切、纯化等步骤对DNA带来的损失，尽可能的保留DNA。
怎么样？这么省样品的建库测序方法你get了吗？据悉，这一新的官方protocol将于2019年2月正式发布，届时，PacBio必将在一些典型的涉及低DNA起始量的领域大展拳脚，如小生物膜的宏基因组分析、穿刺样本中分离的DNA样本、及需要有限扩增的靶向测序和单细胞测序等应用。
参考文献：
Kingan, Sarah, et al. “A High-Quality De Novo Genome Assembly from a Single Mosquito using PacBio Sequencing.” bioRxiv (2018): 499954.
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