以基因组完成图为参考基因组是动植物基因组和医学遗传学研究者们孜孜以求的终极目标之一。而人类基因组完成图则有望帮助我们加深对染色体功能和人类疾病的理解，对基因组变异的全面了解将改善目前使用短读取映射到参考基因组的生物医学中的驱动技术（例如RNA-seq，ChlP-seq，ATAC-seq）。在人类基因组测序组装发展历程中，科学家们陆陆续续发布一系列参考基因组版本。2001年人类基因组计划公布了首个人类参考基因组^[1]，2009年，基因组参考联盟(GRC)发布了人类参考基因组版本GRCh37。2013年人类参考基因组第20个版本——GRCh38发布，在当时被认为是世界上测序最精确的人类基因组，不断修修补补中使用至今。事实上，人类基因组尚未解决的区域还有很多，包括着丝粒周围Mb级别的微卫星区域，近端着丝粒短臂上的rDNA区域，长达几百Kb的片段重复，超过98%一致性的旁系同源基因等。因此，在人类基因组领域，Telomere-to-Telomere的完整组装是实现人基因组完成图的一个关键步骤。

近日发表在bioRxiv上的一项研究，利用Nanopore ultra-long、PacBio、10X Genomics等多种测序技术，组装出首个端粒到端粒的人类X染色体完成图和甲基化图谱，向重建完整的人类参考基因组完成图迈出了关键的一步。

图2 CHM13全基因组组装与验证

研究者采用先前测序的CHM13 BAC 文库（VMRC59 library）来评估组装基因组完整性，在总共341个BAC克隆中，有280个克隆99.5%以上的序列比对至本文CHM13基因组，明显优于其他近期发布的人类基因组（表1）。当用作调用其他基因组中的结构变体的参考序列时，CHM13表现出insertion和 deletion调用平衡，而GRCh38 则表现出deletion调用偏倚。并且GRCh38的inversion数量是CHM13的两倍，表明现有参考基因组可能存在一些定向错误。因此，在连续性、完整性和正确性方面，CHM13组装超过了所有之前公布的人类基因组，包括当前人类参考基因组的一些质量指标。

表1 CHM13组装统计及按照连续性排序的人类参考基因组

初始组装出的X染色体有三个断点，分别是着丝粒区域和两个＞100Kb的片段重复（图2b），利用完全跨越重复区域的Ultra-long read手动解决了两个片段重复断点。通过构建着丝粒DXZ1 中~2Kb重复单元标记索引，引导Ultra-long read跨越整个2.8Mb的着丝粒卫星阵列，PFGE Southern blot实验和ddPCR实验结果与预测组装结果相符（图3a,b,c）。进一步验证，发现DXZ1与PacBio HiFi数据结构变异频率高度一致（图3a,d），表明该X染色体的组装具有极高的连续性和结构准确性。

通过构建21-mer短特异序列标记确定长read在X染色体的位置，从而执行精细的Polish程序，以达到最大的碱基精度（图3d,e,f）。

最终,研究者获得了完整、无Gap、估计精度达99.99%的X染色体，解决了29个参考Gap，总长达1,147,861 bp的N碱基。长read和光学图谱比对表明X染色体覆盖均匀无结构错误（图3e）。初始组装质量较低的区域，在精细Polish后也得到了解决（图2c,d）。

图3 X染色体2.8Mb着丝粒区域验证

2019年7月20日福建省水产研究所与武汉未来组生物科技有限公司合作项目以“De novo Assembly of a Chromosome-Level Reference Genome of Red Spotted Grouper (Epinephelus akaara) Using Nanopore Sequencing and Hi-C”为题，发表在Molecular Ecology Resources（IF=7.049）期刊。福建省水产研究所黄种持研究员、郑乐云教授级高工，武汉未来组胡江，以及集美大学王艺磊教授为共同通讯作者，福建省水产研究所葛辉博士、林克冰研究员，武汉未来组申蜜为共同第一作者，刘雷为共同作者。该研究利用Nanopore测序和Hi-C技术获得了赤点石斑鱼染色体水平的高质量参考基因组，组装基因组大小为1.135 Gb，contig N50为5.25Mb，scaffold N50 达46.03 Mb。该高质量基因组为赤点石斑鱼的分子育种和功能基因组学研究提供了宝贵资源。同时，该研究也表明Nanopore测序产生的长读长序列可以有效提高基因组组装的连续性和完整性。

图1 文章发表信息

赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）属于辐鳍鱼纲（Actinopterygii）鲈形目（Perciformes）鲈亚目（Percoidei）鮨科（Serranidae），是中国、日本和东南亚最具经济价值的重要海洋鱼类之一。由于过度捕捞、食物来源减少、环境污染等导致赤点石斑鱼数量大减，已被列为濒危物种。同时，赤点石斑鱼雌雄同体，雌性先熟，是研究性别倒置，发育，遗传多样性和免疫的良好模型。但是，赤点石斑鱼分子水平的研究却有限，迄今尚未有参考基因组。

图2赤点石斑鱼

利用二代测序数据进行基因组调研分析，预测赤点石斑鱼基因组大小约1,111 Mb，杂合度约0.375%。利用Nanopore GridION X5测序仪对一尾成年雄性赤点石斑鱼（NCBI taxonomy ID: 215347）进行测序，过滤后获得106.29Gb的数据，read平均长度为18.35kb，readN50为26kb。采用Canu+Nanopolish+Pilon的组装策略，获得1.135Gb的基因组，与预测基因组大小相近，contig N50为5.25Mb。

为了进一步提升组装质量，研究者测序了112.83Gb的Hi-C数据，过滤后共有26294万个配对末端序列唯一映射到组装基因组的DpnII切割位点侧翼，随后利用LACHESIS软件进行聚类、排序和定向，将2,055 个contig序列挂载到24条染色体上，挂载率为95.55%，scaffoldN50 达46.03Mb（表1）。BUSCO数据库评估该基因组完整性为96.8% 。

基于Repbase和de novo repeat库，预测该基因组含有43.02％的重复序列，其中以DNA转座子类型的的重复序列最多，占16.73%（表2）。

通过de novo预测、同源比对预测并结合RNA-seq数据集，共预测基因23,923个（表3），其中注释到功能的基因有23,808个（99.5％）。

赤点石斑鱼的各项指标以及完整性均优于5月份发表的黑色石斑鱼参考基因组，可见采用Nanopore+Hi-C策略进行基因组组装优势明显。

表4 赤点石斑鱼与黑色石斑鱼基因组组装比较

本研究利用Nanopore测序技术的长读长优势结合Hi-C技术，组装出高质量赤点石斑鱼染色体水平的参考基因组，这一组装结果表明Nanopore测序产生的长读长序列可以有效地用于基因组组装，并显著提升基因组组装质量。对一个物种而言，完整的高质量的基因组序列是其广义研究中不可估量的宝贵资源，并且是基因组学、基因功能、分子和进化研究的坚实基础，基因组参考序列的质量在一定程度上也体现了该物种的研究进展和水平。

细菌耐药性一直是微生物研究的重点领域，肠杆菌科细菌耐药性的出现和蔓延对人类和动物的健康构成了严重威胁。碳青霉烯类药物、黏菌素和替加环素被认为对多重耐药的革兰氏阴性细菌有效，然而随着碳青霉烯类药物和黏菌素耐药性的爆发，替加环素成为治疗多重耐药细菌感染的最后一道防线。

替加环素的耐药性不可避免的出现，四环素破坏酶Tet(X)具有一种独特的酶促四环素失活机制，研究已证实Tet(X)在体外对包括替加环素在内的所有四环素有降解活性，然而其分布、遗传结构和临床意义仍有待探索。在本研究中，作者描述了一个质粒介导的可移动替加环素耐药基因tet(X4)，并探讨了tet(X4)阳性大肠杆菌在中国人群、食用家禽家畜及其周边环境中的流行情况(图1)。

研究者2017年从猪粪中分离到一株具有替加环素耐药性的大肠杆菌菌株LHM10-1，全基因组测序结果表明LHM10-1的序列类型属于ST515，包含一条4.81Mb的染色体和6个质粒。其中在pLHM10-1-p6质粒上发现了一个全长1158 bp 编码385个氨基酸（图2a）的tet(X)-like基因，命名为tet(X4)。基因克隆实验、平板扩散分析以及四环素降解实验均证明Tet(X4)蛋白能够对整个四环素家族产生耐受性（图2b,c,d）。体内实验表明tet(X4)阴性菌株感染小鼠对替加环素处理高度敏感，而替加环素对tet(X4)阳性菌株感染的小鼠治疗24小时后无明显影响（图2e），由此推测，tet(X4)基因的存在可能是导致替加环素治疗失败的原因之一。

图2 Tet(X4)在体内外对四环素的作用

2、pLHM10-1-p6质粒特征分析

对包含tet(X4)序列的质粒pLHM10-1-p6分析表明，该质粒属于宽宿主范围的IncQ1类质粒，与其他IncQ1质粒比较，它们共享类似的序列区域（图3）。进一步实验发现，可以将替加环素耐药性从大肠杆菌LHM10-1转移到多种实验室菌株中；连续220世代无抗生素培养后，pLHM10-1-p6质粒仍然在不同菌株中稳定存在，表明tet(X4)具有很高的可转移性和稳定性。这也使得质粒pLHM10-1-p6在临床耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）菌株上也表现出良好的转入能力，这些结果暗示：质粒介导的可移动的替加环素耐药基因tet(X4)有可能产生真正的泛耐药菌株，从而导致感染无药可治。

图3 携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6质粒特征

3、tet(X4)阳性菌株的流行情况

本研究从4,189个不同地区和来源的样本中共检测到42个菌株携带tet(X4)基因，这些阳性大肠杆菌分离株在中国东部和南部5个省均有发现(图1)。药敏试验表明，42个tet(X4)阳性菌株全部具有对替加环素、四环素、磺胺甲恶唑-三甲氧苄啶和氟苯尼考的耐药性。质粒分析发现57.1%（24/42）的tet(X4)阳性菌株含有相同的IncQ1类型的pLHM10-1-p6-like质粒。在自传播辅助质粒存在下，IncQ1类型质粒能够转移到广泛的细菌宿主中。携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6-like质粒在转移的过程中，常见的携带mcr-1（一种粘菌素抗性基因）的质粒可以作为其辅助质粒，这进一步促进了替加环素耐药性的传播。

以上研究表明tet(X4)基因导致的替加环素耐药性菌株可能已经在中国传播，作者推测这种新型可移动替加环素耐药性菌株的出现，很有可能是一代或二代四环素的使用导致的。在中国，替加环素只被批准用于治疗人类的临床感染，第一代和第二代四环素被广泛用于治疗食用家禽家畜的感染治疗或者促生长使用，这很可能为替加环素耐药菌的出现提供了选择压力。来自环境、兽医使用以及临床实践的持续选择压力将可能加速tet(X4)等抗性基因的传播。因此，作者强调采用“one-health”策略，即通过对人类、动物及其生活环境进行跨部门监测和控制来应对抗生素耐药性，同时呼吁人们在动物和环境中合理使用四环素。

花生是我国重要的油料作物，富含有益于心脑血管的油酸、亚麻油酸；白藜芦醇，纤维，叶酸和蛋白质等营养物质，被称作“长寿果”。在我国，花生的产量大约3,649千克每公顷，其贡献的产油量占所有油料作物的46%以上，经济价值位于水稻、小麦和玉米后，位于第四位。花生属包含81个种，大多为二倍体（2n = 2x = 20），而栽培种花生（Arachis hypogaea L.）为异源四倍体（AABB，2n = 4x = 40）。细胞遗传学，系统地理学和分子学证据表明，异源四倍体A. hypogaea可能是二倍体A. duranensis（AA）和A. ipaensis（BB）杂交形成，其基因组是野生二倍体的两倍。亚基因组之间的密切关系和高比例的重复序列增加了栽培花生基因组的组装难度。

本研究以中国花生品种狮头企为材料，组装出了染色体水平的高质量花生基因组，组装基因组大小2.54 Gb，包含20条染色体和83,709个蛋白编码基因。利用该高质量基因组，对种子大小进化、种子含油量、抗病性和共生固氮等功能基因家族进行了研究。

比较基因组分析表明相比A亚基因组，花生B亚基因组具有更多的基因和普遍的表达优势，这可能与A亚基因组中LTR的扩增有关，这也引出了A基因组起源的问题，即存在另一个与B基因组更相容的A基因组供体，而不是A. duranensis。

在A. hypogaea和其他豆类染色体进化方面，利用普通豆类基因重建了16条原始豆类染色体（称为Lu），与现存的豆类基因组进行了比较绘制了花生与其他豆类的核型进化图，为花生染色体的形成过程提供新的思路。

在花生起源于进化方面，52份种质材料的重测序分析表明花生可能起源于不同的subsp. hypogaea并且在不同地点独立驯化。

该高质量基因组揭示了许多花生重要农艺性状的候选基因，如种子大小、颜色、叶片抗病性等，将为为后续的功能基因组学研究和花生性状改良提供有意义的线索和数据支持。

参考文献：

Zhuang WJ, Chen H, Yang M, et al., The genome of cultivated peanut provides insight into legume karyotypes, polyploid evolution and crop domestication. Nature Genetics. 2019.

未来组助力完成栽培种花生三代全基因组测序，成果通过专家认证会

2019年4月14日，中国科学院北京生命科学研究院、动物研究所及中国科学院大学等多家单位合作在RNA Biology（IF=5.216）上发表题为“Long-read direct RNA sequencing by 5’-Cap capturing reveals the impact of Piwi on the widespread exonization of transposable elements in locusts”的文章。Nanopore 长读长Direct RNA测序不需要经过反转录可获得完整的RNA转录本。该研究结果证明了5’-Cap捕获法的Direct RNA测序在描述包含重复序列的全长RNA转录本中具有重要作用。这是国内Direct RNA测序相关研究成果的首次亮相，武汉未来组承担了Direct RNA的建库测序工作。

内容摘要

飞蝗（Locusta migratoria）基因组较大，积累了大量的具有内在转录活性的转座子（TEs），TEs插入到内含子中被剪切机制识别，当做外显子添加到RNA转录本中的过程被称为外显子化。外显子化的TEs产生大量的高度相似的片段，运用短读长测序技术很难获得准确的全长RNA转录序列。本研究通过 5’-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本，通过Nanopore对RNA直接进行测序，以天然RNA形式描述飞蝗全长转录本特征。外显子化的TE包含大量的剪接供体和受体位点，有助于形成可变剪切转录本。研究者分析了蝗虫转录中TE外显子化模式，揭示了TE外显子化的广泛建立以及蝗虫转录组中TEs对RNA剪接的重要作用。此外，TEs的表达受Piwi蛋白的限制，分析Piwi表达对包含有TE衍生序列的RNA转录本图谱的影响，结果表明TE衍生序列是Piwi介导的抑制作用的主要靶点，Piwi的表达调控了包含TE衍生序列的RNA转录本长度，产生了可替代的UTR调控。

材料和方法

飞蝗（Locusta migratoria）基因组高达6.5 Gb， 其中转座子（TEs）序列占比高于65%，且大部分具有转录活性。因此，飞蝗可作为研究大型基因组TE结构和功能的理想模型。本研究以羽化的飞蝗为研究对象，通过 5’-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本，5’-生物素化的RNA转录本通过耦合的链霉亲和素免疫磁珠捕获。通过Nanopore对RNA直接进行测序（Fig.1）。

Fig.1  5ʹ-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本流程

主要结果

Nanopore Direct RNA测序作为一种新开发的技术只在少数几个物种中被应用。为了验证其在蝗虫中的可靠性，研究者测定了蝗虫转录组中转录本长度、序列一致性、Isoform覆盖度以及检测的基因数目，结果表明该测序方法可以精确获得蝗虫RNA转录本。

通过Fig.1所示的流程富集全长RNA转录本，RNA转录本5ʹ-末端合成的RNA接头（分为短接头文库和长接头文库）用作序列标签评估RNA转录本的完整性，短接头文库和长接头文库分别产生457,470和269,712条高质量reads。为了验证5ʹ-Cap捕获方法的有效性，研究者检测5ʹ-末端到3ʹ-末端接头的覆盖度，结果发现在长接头文库中大部分鉴定到的接头在5ʹ-末端，但是在长接头文库中5ʹ-末端没有接头富集（Fig.2a）。检测序列一致性及转录本比例，发现其均随长接头序列的减短（沿5ʹ-末端缩短）而增加（Fig.2b）。表明Direct RNA测序获得的RNA转录本5ʹ-末端的极端序列准确性较差。进一步使用长接头5ʹ-Cap富集文库的序列评估RNA转录本的基因覆盖度，编码区和非翻译区域整体覆盖度很好（Fig.2c），表明5ʹ-Cap捕获方法的Direct RNA测序可以获得全长CDS。

Fig.2  5ʹ-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本效果验证

2. 大量的RNA转录本包含外显子化的转座子序列

以最长的RNA转录本作为每个转录本单元的代表序列，在60,908条代表序列中，51.88%（31,599）至少包含1个TE衍生序列，TEs序列长度占整个蝗虫转录组的19.94%。其中，37.45%为DNA转座子，32.93%为non-LTR 逆转录转座子，29.63%为LTR 逆转录转座子（Fig.3a）。家族间的频率分析表明，没有一个特定的家族主要促使其他家族成员的TE共现（Fig.3b）。由此可见，在大部分的RNA转录本中可观察到TE衍生序列的外显子化，并且不同的TE家族对蝗虫的RNA转录本作用不同。进一步分析发现，与5ʹ-UTR和3ʹ-UTR区域相比，编码区显示对TE外显子化更强的选择，而相比于3ʹ-UTR，5ʹ-UTR对TE外显子化更容易（Fig.3c）。

Fig.3  蝗虫转录组TE事件

3.Piwi的表达影响包含TE衍生序列的RNA转录本的长度

80%以上包含TE衍生序列的RNA转录本被认为是蝗虫的转座子，大量的转座子随着Piwi的沉默表达量上调（Fig.4a），RNA干扰的Piwi表达对蝗虫转录组中编码基因的表达有重要影响。dsPiwi样本TE衍生序列的覆盖度高于dsGFP样本，表明dsPiwi样本TE衍生序列内含物水平更高（Fig.4b）。为了探明TE衍生序列产生的可变剪接事件是否与dsPiwi样本更高水平的内含物有关，研究者检测了可变外显子中的TE衍生序列，只有少数（9.82%）可变剪接事件与TE衍生序列有关，大多数（96.88%）TE衍生序列的外显子在dsPiwi和dsGFP中均有发现（Fig.4c），表明可变剪接不是dsPiwi样本更高水平内含物的主要因素。进一步研究发现dsPiwi样本中双表达包含TE衍生序列的RNA转录本长度显著高于dsGFP样本，但是，双表达不包含TE衍生序列的RNA转录本长度在两个样本中没有显著差异（Fig.4d）。dsPiwi样本和dsGFP样本中蛋白编码转录本序列长度的差异主要是由于5ʹ-UTR和3ʹ-UTR区序列的变化而不是CDS区域序列的变化引起的，暗示了由Piwi表达介导的可替代的UTR调控。

Fig.4  Piwi RNA沉默后TE表达活性增强

总之，该研究结果证明了5’-Cap捕获法的Direct RNA测序在描述包含重复序列的全长RNA转录本中具有重要作用。

参考文献

Feng Jiang, Jie Zhang, Qing Liu, Xiang Liu, Huimin Wang, Jing He & Le Kang (2019): Long-read direct RNA sequencing by 5’-Cap capturing reveals the impact of Piwi on the widespread exoniza- tion of transposable elements in locusts, RNA Biology, DOI:10.1080/15476286.2019.1602437