动植物基因组de novo

案例解析

四倍体栽培种花生基因组揭示豆科核型，多倍体进化及作物驯化的秘密

栽培种花生（Arachis hypogaea L.）为异源四倍体（AABB，2n = 4x = 40），其亚基因组之间的密切关系和高比例的重复序列增加了栽培花生基因组的组装难度。本研究在全世界范围内首次破译了四倍体栽培种花生的全基因组，为花生染色体起源、花生及豆科主要类群核型演化、花生基因组结构变异、花生物种起源与分子育种等研究提供新思路。

测序、组装及注释

本研究以狮头企（Arachis hypogaea var. Shitouqi）花生为材料，对100x PacBio数据进行初步组装（平均读长10.25Kb），获得Contig N50为1.51Mb。接着利用Hi-C数据将组装结果提升至染色体水平，N50为129.8 Mb。最后利用高密度遗传图谱对5个含有轻微组装错误的Hi-C结果进行调整，最终组装出大小2.51Gb，包含20条染色体的四倍体栽培种花生基因组。为了评价组装效果，与公布的花生BAC双末端测序数据、三个花生全长BAC序列比对都显示高度的一致性，另外通过二代测序数据和三代的测序数据进行了碱基水平的准确性评估和连续性评估，所有的评估结果表明了花生基因组高质量组装。从花生基因组中共鉴定到30,596个非冗余基因，24,208个同源基因对在两个亚基因组之间表现出广泛的差异表达，其中B亚组的显性表达频率高于A亚组。

表1 花生基因组组装统计

亚基因组结构特征

比较基因组结果表明花生栽培种B亚组与二倍体A. ipaensis一致性高于A亚组与A. duranensis之间的一致性。共有629个基因受到基因转换的影响，有58.7% B转换为A，41.3% A转换为B。A和B亚组之间存在较多的倒转和重组，鉴定到至少6个有明确界限的A、B亚基因组之间的交换或替换，包括染色体3和13之间的10Mb易位。

图1 花生亚基因组与二倍体A、B基因组基因密度、重复序列共线性关系

通过完整的LTR反转座子两端的LTR序列进行比对计算碱基替代率表明A亚基因组在四倍体化后（约25万年前）经历了快速的LTR扩增，而B亚基因组和两个二倍体的LTR在四倍体化前扩增，这可能是由于功能障碍表达的普遍存在或四倍体花生中亚基因组同源染色体的缺失造成的，作者在这里提出疑问：测序的二倍体野生花生A. duranensis是否就是A亚基因组的祖先？

图2 花生及其二倍体祖先的重复序列扩增

豆类植物共有的四倍化（legume-common tetraploidy，LCT；约5900万年前），以及主要双子叶植物共有的六倍化（core-eudicot-common hexaploidy，ECH；约1.3亿年前）痕迹保留在花生基因组中。作者利用保留有Post-ECH和post-LCT的普通豆类基因重建了16条原始豆类染色体（称为Lu），与现存的豆类基因组进行比较并绘制了花生与其他豆类的核型进化图，推断花生染色体的形成过程。花生祖先染色体A1，A3，A4，A5，A6和A7由Lu染色体经过6次融合造成染色体数目减少的片段组成；而A2，A8，A9和A10由两条Lu染色体的交叉互换产生；从A基因组分离以后，B基因组内的交叉互换形成了其特有的7、8号染色体。

图3 花生与其他豆类的核型进化图

亚基因组含量变化

与二倍体花生A. duranensis和A. ipaensis相比，四倍体花生亚基因组A（37,059 genes）和B（46,650 genes）分别有0.88%和12.46%的扩张，在A和B基因组二倍体中鉴定的24,380个同源基因家族中，90.68%在四倍化后仍旧保留。四倍体花生、野生A基因组和野生B基因组中的生长素响应因子（ARF）分别有114、28和28个，聚类为9个簇，其中Ⅰ-V仅包括四倍体花生的拷贝，同时花生含有3个CYP78A6（与种子生长有关），而二倍体B基因组中仅有一个拷贝，这可能与花生籽粒大小有关。驯化过程中同样会出现基因丢失的现象，例如四倍体花生有661个NBS结构的抗病基因，总数少于A. duranensis（385）和A.ipaensis（428）的总和，造成四倍体花生抗病基因的减少。作者还构建了花生基因组水平的酰基-脂质代谢网络和共生（SYM）信号通路基因的系统发育树，为花生品质改良及固氮研究提供支持。

图4 生长素响应转录因子(ARF)家族进化树及脂肪酸代谢、氮共生途径及抗病基因染色体分布

花生的起源和驯化

为了研究花生的起源和驯化，作者构建了52份样品（30个不同生态型异源四倍体花生，18个野生种，4个合成四倍体）的系统发育树（图5b）。系统发育树及测序数据表明野生型四倍体A.monticola形成了subsp. hypogaea和fastigiata生态型，这表明花生可能起源于不同的subsp. hypogaea并且在不同地点独立驯化，例如秘鲁西北地区进化出适应干旱的生态型（图5d，箭头B），东南独立驯化产生的瓦伦西亚和西班牙生态型在世界范围传播（图5d，箭头C和D）。这有别于前人预测的花生由A. monticola在阿根廷北部驯化而来。

图5 花生的进化历史

四个合成四倍体中ISATGR 278和ISATGR 5发生了全基因组的加倍，而另外两个的A基因组分别是B基因组的1.23和5.93倍，这可能是由于亲本染色体由于不相容而在后代中不随机保留，这进一步支持了作者的假设：存在另一个与B基因组更相容的A基因组供体，而不是A. duranensis。

对花生性状改良的影响

该基因组揭示了许多已被基因定位的花生重要农艺性状的候选基因。控制红色种皮的单显性基因定位到3号染色体上一段0.905cM的区间内，包含WRKYs, MYB和bHLH家族以及细胞色素P450等花青素合成相关基因，这些基因的上调表达可能是红色种皮形成的原因。花生种子大小是重要的产量指标，作者利用一个重组自交系群体结合BSA分析在chr07和chr12染色体上定位到两个相同的候选区段，分别包含99和97个候选基因。

图6 种子大小、颜色和叶片抗病性的候选基因

花生叶锈病和晚叶斑病（late leaf spot, LLS）共定位在同一基因组区域，重组自交群体抗病和感病池在Chr13染色体上显示重叠区域，进一步分析表明该区段内保守的Tir-NBS-LRR基因AH13G54010.1可能是两种病害的抗病基因。从含油量约40%的材料中获得了含油量高达80%的突变系，并通过重测序结合四倍体组装基因组解释了高含油量是由于ahFAD2A和ahFAD2B两种突变共同引起的。

参考文献：

Zhuang WJ, Chen H, Yang M, et al., The genome of cultivated peanut provides insight into legume karyotypes, polyploid evolution and crop domestication. Nature Genetics. 2019.

https://doi.org/10.1038/s41588-019-0402-2