原创文章  作者 贺少方

三代测序那些事儿开贴以来一直是在讲三代测序君PacBio的发家史，其实三代测序这个行当里还有另外一位仁兄Oxford Nanopore，一直被大家忽略却也是蛮拼的一个家伙。小编今天就换个口味，给大家聊聊Nanopore MinION君是怎么逆境中求生存的。

Oxford Nanopore 2014年推出其掌上测序仪MinION试用计划，同样具有单分子测序与超长读取能力，摒弃了边合成边测序的设计思想，采用单条核酸链中不同碱基通过蛋白纳米孔是产生的电流变化来标定碱基顺序，这一独具匠心的设计造就了其U盘大小的体积、多种大分子（蛋白质、RNA、DNA）通吃、单分子超长读取等诸多特殊能力^[1]。

之后其30%的原始错误率饱受诟病，这其中就包括其首批试用用户伯明翰大学的Nick Loman，他首次试用后发现λ噬菌体的MinION数据因为较高的原始错误率仅有25%可以mapping回参考基因组，表示不好用。

但是短短一年时间里，MinION似乎找到了突破这一窘境的办法，测了埃博拉、分了HLA、装了基因组（酿酒酵母、不动杆菌、大肠杆菌），显示了自己在测序领域中的三代地位^[2-5]。

小编分析了上述提到的那几个MinION基因组的案例，发现MinION君确实是从PacBio君身上学到了不少东西，虽然两位在测序原理上是天差地别，但所产数据类型很相似的，读取很长（平均读长数Kb级别），原始错误率略高，而学到的主要的东西还是对原始reads的比对、校正思路、算法等，这些帮助了MinION慢慢脱贫致富，以下搜集的两组案例说明了这个问题。

E．coli K12 的纯MinION数据组装

最近（2015年2月）放在冷泉港预印本网站bioRxiv上的一篇单独使用MinION数据组装大肠杆菌E.coli K12基因组到完成图级别的文章便是一个很好的例子，比较巧的是这篇文章的作者便是文章第三段提到的那个嫌弃MinION不准的那个伯明翰大学的Nick Loman教授。

Nick Loman使用了21X的MinION 2D  reads（4 MinION Runs，平均读长~8kb）对E.coli K12的基因组装。DNA链的先导链和滞后链均被测到所产生的reads称为2D （two-Direction）reads，约占总数据的25%。 相较于普通的reads具有更高的准确率，结合新型试剂测序R7.3以及新型的base caller可以使2D reads准确率达到78%-85%，略低于PacBio的85%。

E．coli K12的组装过程也采取了类似于PacBIO组装过程中的先校正后组装的思路。校正过程中采用的DALIGNER比对算法、pbdagcon一致性算法均是之前针对PacBio数据所开发的，最后使用OLC算法的Celera Assembler对校正后的数据（准确度97.7%）进行了组装。

组装得到1条4.6M的contig，基本达到了完成图级别，与E.coli K12参考基因组相比，单碱基准确率为98.4%，有两处组装错误。

这一组装结果已经确实已经显示出了MinION在细菌完成图组装中的优秀性能，准确率方面的问题相信通过后期试剂、算法的更新会有较大的改善。

基于MinION数据的混合组装（不动杆菌 & 酿酒酵母）

除过大肠杆菌E.coli K12的纯MinION三代数据组装，MinION君之前也通过二三代数据混合组装的方式在不动杆菌A. baylyi 与 酿酒酵母S.cerevisiae中进行过尝试。

不动杆菌A. baylyi的二三代混合组装过程使用了23X的MinION数据与50X的illumina数据，利用针对MinION的新型组装算法NaS最终组装得到3条Contig，最后利用MinION数据使用SSPACE做Scaffolding，最终得到1条Scaffold。

酿酒酵母的二三代数据组装过程使用了121X的MinION数据，若干Miseq数据， 采用针对PacBio的PBcR思路进行组装，不过数据校正过程中使用到的比对算法为针对MinION开发的新型比对算法Nanocorr，一致性算法为HGAP中的pbdagcon，最后组装得到的ContigN50 为479kb，单碱基准确率99%以上。

最后，对于 MinION君的前途，不管你看不看好，反正我很看好。

Paper：

[1] Bayley H et al. Nanopore sequencing : from imagination to reality. Clin Chem.  2015

[2] Nicholas J. L et al. A complete bacterial genome assemble de novo using only nanopore sequencing data. bioRxiv . 2015

[3] Madoui MA et al. Genome assembly using Nanopore-guided long and error-free DNA reads. BMC Genomics. 2015 .

[4] Oxford Nanopore Sequencing and de novo Assembly of a Eukaryotic Genome. bioRxiv. 2015

[5] Ron Ammar et al. Long read nanopore sequencing for detection of HLA and CYP2D6 variants and haplotypes. F1000Res . 2015

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这期的三代测序那些事儿，小编要为那些研究人类疾病的小伙伴们献上一款刚刚在BMC Genomics发表（2015-04-22）的结构变异检测神器Parlianment。

文献链接：

http://www.biomedcentral.com/1471-2164/16/286/abstract

Parlianment是由Baylor医学院人类基因组测序中心生物信息学家Adam English领导开发的一个针对人类基因组的结构变异检出流程。小编看着这名字眼熟，百度一下发现原来PBjelly也是出自这位仁兄之手，PBjelly是一款利用PacBio长读取数据对现有基因组进行升级的软件。所以在Parlianment中引入PacBio三代测序数据进行SV检测也就不奇怪了。

这款软件的最大特点便是它能够同时输入多种类型数据进行SV位点的检测，比如Mate Pair / Pair End （Illmina）配对数据、PacBio长读取数据、BioNano光学图谱数据、aCGH芯片数据等，最大限度的检出存在于个人基因组中的结构变异信息，该软件的测试版目前是搭建在DNA云计算公司DNAnexus提供的云端服务器上。Parlianment工作流程见图1。

                                           图1 Parlianment work flow

        该流程首先整合了多款SV检测软件，包括针对Mate Pair数据的SVachra，针对Pair End数据发现小型变异的Breaddancer、Delly、CNVnator、Pindel、Crest、SV-STAT、Tiresias、Spiral，针对PacBio数据的PBHoney等，从而实现了利用多种类型数据检出待选变异位点，之后根据二三代数据的局部混合组装结果（PHRAP软件）、PacBio长读取Reads等进一步筛选出可信度较高的SV位点用于后续的科学研究。

关于该软件的性能，Adam等人使用了2X Illumina Nextera（6.5kb MatePair）、10X PacBio、51X的BioNano、CGH芯片数据（4,200,000个探针）的个人基因组HS1011数据对Parlianment进行了评估。

总共检出了31,007个结构变异位点，大小分布在100bp-1Mb之间。其中7,708个位点有local assembly结果支持（10X PacBio 与 48X illuminePE 利用PHRAP软件混合组装），1103个无组装结果支持的位点有多个类型的数据支持，966个无组装结果支持的位点有PacBio数据与另外一种其他数据支持。

利用Parlianment在个人基因组HS1011上找出了9,777个高可信度的结构变异位点。其中4352个位点比对到了基因组结构变异数据库（Database of Genomic variants, DGV）中，造成这一结果的原因可能是新型变异位点存在或者DGV数据库的不完善。

研究者使用long-PCR手段对这一结果进行了进一步评估。用来验证42个缺失突变（平均长度为10.6kb的）扩增子Sanger测序结果与Parlianment预测结果相差的平均碱基数仅为2个，显示出了预测结果的高度可靠性。

最后研究单独使用Illumina数据或者PacBio数据，检出的可信SV位点分别为3082、4,268，远远少于上述整合多种类型数据得到的9,777个。

到下班点了，小编就不多说了，这款软件的性能到底怎么样，还得小伙伴自己装起来run一下才知道嘛。

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在这期的三代测序那些事儿里，小编为大家介绍一个基于PacBio SMRT三代测序技术的新型基因组解决方案“基因组denovo 3.0 ”。该方案是由我们未来组（Nextomics）信息分析部的同事经过两年多时间的研发，各项参数在三四个大型动植物基因组、数百个小基因组的组装过程中反复优化，最终将这一国内目前最给力的基因组解决方案呈现给大家。

在推出我们的基因组denovo3.0之前，先上一个我们最近的一个超高杂合度的植物基因组的纯三代数据组装实例让各位小伙伴感受下:

该植物基因组的杂合度高达耸人听闻的3%，一般情况下杂合度大于0.8%的基因组便被划入了复杂基因组的范畴，3%的杂合度对于玩基因组组装的人来说绝对算的上一个噩梦。

杂合度问题一直是困扰传统的短读长 NGS 测序平台的固疾，因此面对这种超高杂合度的植物基因组，我们直接摒弃了NGS测序平台，转而使用了一种超长读取（平均读长约15kb）的新型测序技术PacBio SMRT，该技术小编已经在前面几期的文章里详细阐述，这里不作过多介绍。

我们使用了70X的纯PacBio数据，利用针对PacBio数据开发的、专门解决二倍体多倍体组装的最新组装算法FALCON对该基因组进行了组装，各项参数经过多个版本的调试，最终得到了ContigN50 值406kb的傲人战绩。与之前国内某巨头公司使用NGS数据组装得到的 18.5 kb 相比，完全高出一个数量级。

当然基因组组装的记过不能只看 ContigN50 指标，毕竟部分组装软件在这个问题上采用了选取最长路径的粗暴做法。因此，我们使用之前得到的该植物的根、茎、叶、穗四个部位的mRNA数据对基因组组装的准确度进行了一个评估，并与之前的NGS组装版本进行了比较，基因区覆盖度结果如下：

穗 PacBio VS NGS 91.09% VS 88.92%；

叶 PacBio VS NGS 87.33% VS 87.98%；

根 PacBio VS NGS 89.41% VS 89.39%；

茎 PacBio VS NGS 91.73% VS 90.20%。

因此，在准确度上，PacBio也是绝对是不输于NGS的。

除过纯三代数据组装，我们二三代数据混合组装的案例杜仲基因组也在去年12月份北京的新闻发布会上为大家呈现过，在这个案例中，我们仅在NGS数据中引入了8.7X的PacBio数据，使用SSPACE、PBjelly、Platanus等软件对这个杂合度大于1%，重复序列比例大于66%的复杂基因组进行了组装，最后的ScaffoldN50接近了1M，通常情况下这一数值小于300kb，详细信息大家可进入链接http://news.china.com.cn/2014-11/26/content_34156870.htm。

感受完我们的demo case强力气场后，小编这就拿出我们的基因组denovo 3.0

1）动植物基因组 denovo 3.0

测序平台：PacBio RSII

测序深度：50X-100X（~20kb文库）

预计指标：ContigN50 >500kb ，ScaffoldN50>1M （20X BioNano辅助）

最新科研思路：多倍体起源进化、微进化（泛基因组）等^[1-4]

2）微生物基因组 3.0

测序平台：PacBio RSII

测序深度：100X-200X

承诺指标：细菌完成图（No GAP ，NO N）；

真菌接近完成图（ContigN50>800kb）；

5mC、4mC、6mA修饰位点检出

最新科研思路：致病菌相关研究^[5-8]

最后欢迎访www.nextomics.cn了解更多的三代测序产品。

Paper：

[1] De novo assemblyof soybean wild ralatives for pan-genome analysis of diversity and agronomictraits.

[2] Highly evolvablemalaria vectors: the genomes of 16 Anopheles mosquitoes .

[3] Earlyallopolyploid evolution in the post-neolitihic Brassica napus oilseed genome.

[4] Achromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticumaestivum) genome

[5] The extant Wordwar1 dysentery bacillus NCTC1: a genomics analysis.

[6] Single- moleculesequencing to track plasmid diversity of hospital-associated carbapenemaseproducing enterobacteriaceae.

[7] Emergence ofscarlet fever Streptococcus pyogenes emm12 clones in Hong Kong is associated withtoxin acquisition and multidrug resistance.

[8]A random six-phse switch regulates pneumocaccalvirulence via global epigenetic changes.

可靠消息，国内某测序巨头准备引进Pacbio SMRT测序平台PacBio RSII系统开始进军三代测序市场，按照惯例，其他小巨头也会紧随其后，所以，小编深深觉得，今年国内肯定要刮起一阵不小的三代测序风，三代测序市场的竞争也将变得激烈起来。

从09年PacBio RS首批测试数据公布暴露出15%的原始错误率（主要为InDel错误）后开始遭人诟病到13年PacBio SMRT首次进入中国市场（Nextomics首家推出）而又普遍不被看好再到如今被国内主要NGS测序公司争相追捧，在小编看来，这算得上是PacBio SMRT君的一次华丽逆袭。

这期，小编将为大家盘点那些让PacBio SMRT君华丽逆袭的那些算法。

显然，直接使用原始错误率为15%且大多数为InDel错误的Reads进行基因组拼装是不可行的，因为大多数基因组组装软件所能忍受的Reads上限错误率<~5%-10%。因此对PacBio RS平台所产生的Reads（错误随机分布）进行比对 & 校正成为了此类数据应用于基因组组装的第一步。

然而大多数比对软件主要是针对高准确率短读长的NGS测序数据设计，比如 SOAP、Bowite、BWA、Maq、SHRIMP、ELAND等，无法对这种读长为数kb、原始错误率15%的三代数据进行比对，虽然在BWA基础上修改得到的可容忍较高错误率且能够进行长读长数据进行比对的BWA-SW却有着比对率不高的缺点。

以下两款专门针对PacBio数据的新型比对软件的出现改变了PacbioSMRT君的这一窘境，也开启了PacBio君的逆袭之路。

NO.1 BLASR （主要针对微生物基因组）

BLASR是基于经典动态规划思想设计的局部比对软件，使用了BWT（Burrows-wheeler Transform）格式的索引结构进行匹配区域快速定位，对于候选匹配区域与最终匹配区域的确定使用了运算速度更快的稀疏动态规划算法（Sparse Dynamic Programing）。

加利福尼亚大学的软件开发人员首先使用产生于大肠杆菌E.coli OH104：H4基因组的48X的PacBio数据（10.7% insertion、4.3% deletion、0.9% substitution）对BLASR的mapping 率、mapping速度进行了评估，结果显示，BLASR mapping率为90%，高于BWA-SW的50%，运行时间为20min 54 S ，小于BWA-SW的434 min 5S。

为了评估该软件的mapping准确率，软件开发人员使用了大肠杆菌基因组的Pacbio 模拟数据对基因组进行mapping，结果显示90%以上的reads mapping 准确度在99.99%以上。见图8^[1]。

        BLASR凭借其优秀的mapping品质与多款Consensus算法软件（AMOS、Quiver、PBDAG-Con等）一起构成了多款后来出现的针对Pacbio数据的基因组组装软件的核心校正算法，这些软件包括二三代混合组装软件PBcR-BLASR、AHA，纯三代组装软件HGAP。

其中纯三代组装软件HGAP（Hierarchical Genome-Assembly Process）是一款基于分级组装思想的基因组组装软件。其大致流程为：

1）挑选较长的reads作为seed reads（>6kb）

2）使用BLASR将较短的的reads mapping 的seed reads上，使用PBDAG -Con一致性算法对reads进行校正并进行预组装

3）使用CA算法对预组装得到的准确率较高的长Reads进行组装

4）将原始reads mapping回组装好的基因组，使用新型一致性算法Quiv er对所得基因组进行进一步校正，最终得到准确率大于99.9999%（QV60） 的高质量的微生物基因组图谱。大致流程见图1。

        Stephen Turner等人分别使用了100X、90X、100X的大肠杆菌、栖热菌、肝素黄杆菌PacBio数据对HGAP的组装效果进行了评估，组装结果中Contig数分别为2、3、1^[1]。

随着Pacbio SMRT的读取长度、运行通量的增加，之前出现的二三代混合组装软件相较于纯三代组装软件HGAP，无论是在测序成本还是组装指标均没有优势，因此，这种二三代混合组装的策略在微生物基因组组装中慢慢被淘汰，对于之前提到的那些二三代混合组装小编就不做过多赘述^[3][4][5]。

NO.2 MinHash（针对大型动植物基因组）

MinHash也是一款基于经典的动态规划思想设计局部序列比对软件，与BLASR不同的是，它采用了最小哈希算法（MinHash）实现了匹配区域的快速定位，该过程如图1所示。

        大致流程为：1）reads Kmer化， 2）将Kmer通过 Hash方程转化为整数格式的fingerprints，3）挑选各自fingerprint最小的Kmer组成用于比对的Kmer集合Sketch 4）使用Jaccard相似度计算Kmer相似度 5）若相似度超过阈值，则返回基因组区域使用动态规划算法详细比对 6）找出匹配区域。

包括Pacbio 的Chen-Shan Chin在内的软件开发人员使用拟南芥、果蝇、人类的PacBio测序数据评估了MinHash算法在大型基因组测序数据比对过程中的性能。结果显示Mapping率在80%左右，准确率均在90%以上，而运行时间仅为15-21 CPU h ，而另一款主要应用于微生物基因组数据比对的BLASR的在大型基因组测序数据比对时运行时间高达上百 CPU h [6]。

之后软件开发人员将MinHash结合新型Consensus软件FalconSense，再整合到OLC组装算法软件Celera Assembler（CA）中得到了大型基因组纯三代组装算法PBcR-MinHash。软件开发人员分别使用了121X、144X、54X的果蝇、拟南芥、人类葡萄胎的Pacbio数据对PBcR-MinHash的组装性能进行了评估，三个物种的ContigN50分别达到了11Mb、20Mb、4Mb。

至此，PacBio SMRT君通过内在的修为弥补了表面缺陷，完成了自己的逆袭之路。

未来组生物（Nextomics Biosciences）基于HGAP已经推出了多款微生物基因组完成图产品，在动植物基因组方面也成功召开了基于三代测序技术的杜仲基因组新闻发布会，感兴趣的小伙伴可以电话或邮箱联系我们。

Paper：

[1] Mark J Chaisson et al. Mapping single molecule sequencing readsusing basic local alignment with successive refinement (BLASR): application andtheory. BMC Bioinformation . 2012

[2] Stephen W Turner et al. Nonhybrid, finished microbial genomeassemblies from long-read SMRT sequencing data. Nature Mehods. 2013

[3] Sergey Koren et al. Hybrid error correction an de novo assembly ofsingle molecule sequencing reads. NatBiotechnol . 2012

[4] Ali Bashir et al. A Hybrid Approach for the Automated Finishing ofBacterial Genomes. Nat Biotechnol .2012

[5] Filipe J Ribeiro et al. Finished bacterial genomes from shotgunsequence data. Genome Research. 2012

[6] Konstantin Berlin et al. Assembling large genomes with singlemolecule sequencing and locality sensitive hasing. Bio Rxiv. 2014

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上期和大家分享了几个三代测序技术在基因组组装中的应用案例，无论是在大型的基因组组装项目亚洲人基因组计划、还是在复杂致病菌基因组(痢疾杆菌、幽门螺杆菌等)测序项目中，三代测序技术 PacBio SMRT 均有着不俗的表现。

这期，小编将结合几篇文献为大家盘点那些使PacBio SMRT迅速崛起的特殊能力。

NO.1 单分子测序

能力描述：

首先要提到的是PacBio SMRT测序平台PacBio RSII的单分子测序能力，这在其他的两个三代测序平台 HeliScope & MinION 也有所体现，这也成了三代测序区分于二代测序的一个标志性特征。

HeliScope 是 Helicos 公司于2008年推出的全球第一台三代测序平台，但由于读长(35bp)、售价等原因在推出后的几年内便惨淡退出测序市场，Helicos公司也于2012年申请了破产保护。 Oxford Nanopore 公司的便携式纳米孔测序 ( Nanopore Sequencing ) 仪MinION目前还处于早期的客户测试阶段，首批测试数据的平均读长已达到了5.4kb，还是有较好的市场潜力。

单分子测序过程通常无须PCR(二代测序中为了将目的荧光信号从背景荧光中区分出来，测序前需要对单条模板链PCR成簇，以放大检测信号)过程，避免了二代测序常遇到的GC偏好性 ( GC bias ) 问题，因此 PacBio RSII 所产生的数据具有极低的GC偏好性，这种数据对于组装高GC基因组或者基因组中高GC区域是非常有利的。

另外, PacBio RSII 单分子测序的特点也使该平台在碱基读取 ( base calling ) 过程中不会出现二代测序平台常遇到的移相(dephasing)问题，所产生的数据更加准确，目前 PacBio RSII 所产生的数据一致性准确率 ( consensus accuracy ) 可达99.99%，如果使用新型一致性算法Quiver，一致性准确率可进一步提高至99.9999%。

相关案例：

1)PacBio SMRT组装高GC基因组相关案例：

Advantages of Single-Molecule Real-Time Sequencing in High-GC Content Genomes

韩国极地研究所研究团队使用 PacBio RS ( Pacibo RSII 早期型号)平台对一株分离与南极乔治王子岛的 Streptomyces 菌株进行了测序，该菌株基因组 GC 含量高达 71%，之前使用 200X 的 Hiseq 2000 数据进行过组装，仍没有获得完整的基因组，组装产生了185 个 contigs ， 随后使用 Sanger 法也仍然无法有效填补。随后研究人员使用仅15 X 的 PacBio SMRT 数据 ( CCS reads + long reads ) 就得到了26个 contig 的组装结果，与二代组装结果比较，发现，二代组装结果中大多数难以填补的Gap多为一些高 GC 区域。

2)PacBio SMRT组装基因组中高GC区域相关案例：

Resolving the complexity of the human genome using single-molecule sequencing

同样地，华盛顿大学的研究团队使用 PacBioRSII 平台对一个人类葡萄胎基因组 （ CHM1 ) 进行了测序，将测序数据 mapping 回人类参考基因组 GRCh37 上，在 GRCh37 GAP区域进行了局部组装 ( local assembly ) ，该研究填补和缩小了人类参考基因组 GRCh37 上接近100个 Gap，这些 GAP 大部分处于高 GC 和重复区域，其中包括一些重要基因表达调控元件。

能力小结：

上述两个案例再次证明了，PacBio RSII平台所产生的极低GC偏好性的数据在高GC基因组或高GC区域的组装中确实有着显著的优势。

对PacBio RSII实现单分子测序的技术原理感兴趣的小伙伴可阅读Stephen Turner ( PacBio 公司创始人 ) 等人在2003年发表在 Science 上一篇关于 ZMWs 的经典文献：

1. W. Turner, et al. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations. Science. 2003

NO.2 超长读长(super long-read)

能力描述：

吸取了Helicos公司在三代测序平台开发上的失败经验，PacBio公司在单分子测序的基础上又进一步开发了一套使其三代测序平台 PacBio RSII 更加完美的长读取技术，主要是利用了一种将荧光染料标记于磷酸链末端的dNTP作为边合成边测序(Sequencing by synthesis ) 时的反应底物，聚合反应时，荧光基团可随着焦磷酸基团被DNA聚合酶自然切除，无需其他化学试剂洗脱，最大限度保护了DNA聚合酶活性。

基于该技术，PacBio RSII使用最新的P6C4试剂使测序平均读长由原来的P5C3的8.5 kb 又进一步提高到了10kb-15kb，而早在2005年就诞生的第二代测序技术的读长水平目前还徘徊在数百bp。

PacBio RSII 目前的平均读长(10-15kb)超过了大部分细菌基因组中最大重复区域长度 & 一些小基因组大小(部分病毒基因组、动物线粒体基因组、大部分质粒) & 普通转录本长度。因此，无论是在对于基因组的组装，还是对于转录组的Isoform识别，PacBio SMRT均有着其他测序技术无法比拟的优势。

相关案例：

1)PacBio SMRT在高重复高杂合基因组组装中的应用案例：

杜仲基因组是一种高重复高杂合的基因组，杂合率>1%，重复序列在66%以上，为了解决这类复杂基因组的组装，未来组生物使用了10X PacBio SMRT 长度数据，通过新开发的组装流程，结合第二代测序数据，使得Scaffold N50达到932kb(第二代测序组装对于解决复杂基因组组装存在一定的瓶颈，一般会导致Scaffold N50 小于300kb)，这一成果也在去年的《杜仲全基因组测序重要研究成果》北京新闻发布会上进行了展示。

能力小结：

除过基因组组装外，Pacbio SMRT 也被应用于转录组测序中，由于超长的读长能够使其直接读取完整转录本，无需拼装，该技术已被应用于可变剪辑、基因融合、lncRNA 等转录组分析，从2013年至今，已有数十篇该类文献发表，小编挑了一些比较有代表性的供大家参考。

[1]Sharon, D. et al. A single-molecule long-read survey of the human transcriptome . Nature Biotechnology. 2013.

[2] Tilnger, H. et al. Defining a personal ,allele-specific,and single molecule long-read transcriptome. PNAS. 2014.

[3] Zhang, W. et al. PacBio sequencing of gene families — A case study with wheat gluten genes . Gene . 2014.

NO.3 碱基合成动力学信息记录

能力描述：

PacBio SMRT采用新型的核苷酸荧光标记技术，实现了边合成边测序(Sequencing by Synthesis)过程聚合反应的连续进行，PacBio的工程师们使用了一台内置有帧率100HZ的电子倍增CCD(EMCCD)相机的共聚焦荧光显微系统实现了对这一过程的实时(Real-time)监测，因此Pacbio RSII 在记录碱基先后顺序的同时也记录下了碱基渗入模板链的速度(碱基合成的动力学信息)，DNA聚合酶在甲基化修饰或者磷硫修饰位点处反应速度有所降低，在合成动力学信息中，则表现为荧光脉冲信号的延迟(increased interpluse duration，IPD )。基于此原理，PacBio RSII在DNA序列测定的同时获得了其甲基化修饰位点信息。

相关案例：

1)PacBio SMRT在甲基化修饰位点检测中的应用：

Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing

布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital,BWH)等机构的研究人员利用了PacBio SMRT测序技术对溶血性尿毒病原菌E.coli O104：H4基因组中的化学修饰位点进行了测定(190X测序数据)，分析了基因组中的5mC与6mA修饰，由此绘制了全球首张致病菌全基因组水平甲基化修饰位点图谱。

2)PacBio SMRT在磷硫修饰位点检测中的应用：

Genomic mapping of phosphorothioates reveals partial modification of short consensus sequences

来自上海交通大学的研究团队利用 Pacbio RSII 对大肠杆菌基因组中的磷硫酰化修饰(PT)位点进行了测定，绘制了全球首张细菌全基因组水平磷硫酰化修饰(PT)位点图谱。

能力小结：

DNA化学修饰位点检测是表观遗传学研究的重要内容，基于PacBio SMRT 的 DNA化学修饰位点检测技术操作更加简单(无需重亚硫酸盐处理)、表观修饰检测类型更加多样、准确性更高等优点。

小编还意犹未尽，但限于篇幅，今天只能到这里了，下期接着聊。下期将为大家聊那些为三代而生的算法们，敬请关注!

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