科研速递|Nature Communications最新文章连连看

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单分子测序组装首条非裔人类Y染色体

2019年1月2日，Nature Communications上收录了一篇短小精悍的文章，基于目前仅有欧裔人类参考基因组级别的Y染色体现状，来自西班牙进化生物学研究所的学者们使用ONT平台装配出了首条非裔人类Y染色体，且提升了800%的连续性！原始RNA测序还便于研究者从Nanopore电信号数据中识别甲基化修饰，该研究提供的方法还可以推广到其他任意大型重复基因组的简化组装中。

简单来说，研究从一个淋巴母细胞系（HG02982）中分离出约9000000条染色体，依照自主设计方案纯化后在4个Nanopore芯片上生成了305528条reads，然后进行Illumina双端测序，在使用Canu进行组装后使用Nanopolish进行校正，再通过pilon对组装结果进行校错，最终组装出的Y染色体含35条contigs，N50为1.46Mb，序列总长为21.5Mb。

研究者将其与GRCh38以及大猩猩的Y染色体进行了比较，相对于大猩猩组装的contig N50为17.95kb，本次组装的连续性提升了两个数量级。

下表是基于本研究组装的Y染色体（HG02982）和GRCh38以及NA23385进行序列覆盖的比较。

组装统计

此外，研究者还将基因注释结果与GRCh38进行了比较，并鉴定了其中的结构变异和CpG甲基化的分析等。

人类Y染色体因其高度重复的特性而使其组装充满挑战，但是通过Oxford Nanopore组装出的结果明显优于之前的长读长WGS组装的结果，且更为经济，这预示着将来完整的Y染色体组装将成为可能。

文章来源：

https://www.nature.com/articles/s41467-018-07885-5#Sec9

3000份基因组数据描绘亚洲水稻逆转录转座全景图

2019年1月3日，NC刊登了一份从物种水平研究水稻遗传多样性的成果，来自法国佩皮尼昂大学的Olivier Panaud研究团队通过开发一款名为TRACKPOSON 的工具，从3000份水稻重测序项目数据集中识别出了32种不同家族的逆转录转座子的超过50000个TIPs（转座元件插入多态性），描绘了亚洲稻逆转录转座的全景图。

研究人员使用TRACKPOSON对传统的基于成对末端mapping和reads分离的方法进行优化，先把成对的reads 比对到特定转座子的一致序列上再把提取后的reads比对到参考基因组上,从而省去了传统的将全部reads比对到参考基因组上的繁琐计算以快速、准确地鉴定已知转座子家族的TIPs。

TRACKPOSON工具分析流程

通过这个方法检测了32个家族的逆转录转座子在3000个水稻基因组中的位点，识别出53262个TIPs并且发现识别到的TIPs在群体中大部分是低频率出现的，推测这些TIPs可能是在进入到农业时代后于近期形成。

研究人员还进行了GWAS全基因组关联性分析，探查到相比于转座元件沉默通路上相关遗传因子的改变，这些TIPs可能由外部刺激引起个别转座子的跳跃而诱导激发。另外，TIPs数据还被用来进行水稻起源的分析，研究使用古生物基因组学分析手段发现籼稻（Indica）、粳稻（Japonica）和Aus/Boro水稻的基因组在水稻驯化之前已经具有明显分化，可以推断水稻起源于三个不同的驯化事件。

文章来源：

https://www.nature.com/articles/s41467-018-07974-5#Sec8

参考微生物中m6A的单分子测序检测

DNA碱基修饰N6-甲基腺嘌呤（m6A）参与许多与细菌生存及其与宿主交互作用相关的路径。本研究通过与之前的方法（衡量在每个腺嘌呤通过一个纳米孔时测量值和预期电流值之间的偏差）进行比较，展示了一种新的便携式神经网络算法来检测碱基修饰。该模型通过McAller软件包实现，可以扩展为基于未经模拟甲基化预测的候选甲基转移酶靶模体检测工具。

研究使用PacBio、Oxford Nanopore、甲基化DNA免疫沉淀测序（medip-seq）和全基因组亚硫酸氢盐测序数据来生成、验证8种微生物参考物种甲基化组。这些特征描述详尽的微生物参考基因组可用来研发、评估未来从单分子测序数据中识别碱基修饰的方法。

当m6A周围的DNA穿过nanopore时picoampere电流偏离模型值

研究成果于2019年2月4日发表在NC上，总之，和传统方法相比，该方法能够提升碱基修饰的检测。近期发生在国际空间站、西非埃博拉病毒以及美国寨卡病毒的爆发期间都使用到了Nanopore测序方法，证实了远程基因组研究和表观基因组学研究的无限价值。

文章来源：

https://www.nature.com/articles/s41467-019-08289-9

Direct RNA-seq重新定义病毒病原体转录复杂性

传统的RNA测序方法鉴定复杂的病毒转录组时会因高基因密度、重叠阅读框以及复合的剪切产物而变得困难重重，而direct RNA-seq不失为一种可靠的替代方法。本研究对HSV-1病毒转录组进行直接RNA测序，展示了其在定义与所有多聚腺苷酸化病毒RNA相关的转录起始和RNA裂解位点上的优势，并证明低水平的read-through转录产物产生了一类新的嵌合HSV-1转录本，包括一种编码病毒E3泛素连接酶ICP0和病毒膜糖蛋白L融合的功能性mRNA。因此，direct RNA-seq为表征复杂基因组病毒转录格局变化提供了强有力的方法。

有意思的是，研究将direct RNA-seq和Illumina RNA-seq进行了比较，通过分析发现无论是Illumina还是Nanopore测得的基因区的平均read深度较基因间区要高，这种差异反映了Illumina标准流程中在poly(A)选择阶段富含腺苷区域的mis-priming，相反，在direct RNA-seq中，接头耦合启动蛋白的连接要求意味着只有多聚腺苷酸化的RNA才可以通过nanopore。

图a是poly(A) RNA对HSV-1基因组范围100nt滑动窗口的覆盖情况，黑色线条代表Nanopore测序结果，红色虚线为Illumina数据，红色实线为转化为与Nanopore数据相同覆盖度后的Illumina结果；图b是Nanopore和Illumina测序产生的HSV-1基因组覆盖度关联分析；图c表示direct RNA-seq和标准化后的Illumina数据集的基因和基因间区域的read深度值（100 nt间隔）的点图。基因区和基因间区的read深度平均相差12.08倍（Nanopore）和6.82倍（Illumina）。图d和e是通过和两个版本的HSV-1转录组比对计算Nanopore和Illumina数据集的转录丰度。

该研究阐述了direct RNA-seq在复杂病毒上的价值，确定RNA多样化在病毒感染中的机制将大大提高人们对宿主-病毒之间的交互作用的理解。

文章来源：

https://www.nature.com/articles/s41467-019-08734-9#Abs1

PacBio技术破译首个木兰类植物——牛樟基因组

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木兰亚纲（Magnoliidae）隶属于种子植物中的被子植物，含超过9000个种和四个目（白桂皮目、胡椒目、樟目和木兰目）。来自我国宝岛台湾生物多样性研究中心和医学科技学院的多名研究人员首次聚焦木兰亚纲樟目樟科樟属的牛樟，结合PacBio、Hi-C、Illumina等技术平台组装出了其reference级别的基因组并进行注释。13种代表性的种子植物系统发育分析表明，相较于单子叶植物，木兰亚纲和双子叶植物之间有着更近的祖先；在木兰亚纲谱系间发生了两次全基因组复制事件（WGD）：一次早于樟目和木兰目之间的分化，另一次在樟科的分化之间。樟属演化史中也有小片段复制和串联重复事件的作用，如月桂中萜合成酶基因亚家族的扩张造就了肉桂单萜和倍半萜的多样性。文章见刊Nature Plants，该期刊影响因子为11.471。芳香药用植物在人类历史上有着重要的工业和药用价值，而樟属更是分布于亚洲和南美在经济和生态上重要的常绿芳香树种。但是木兰类植物之间的谱系关系却一直有待明确。牛樟作为台湾特有的植物因其巨大的树干、芳香、耐腐的特性而有着不可估量的价值，同时也因为砍伐过度、种子发芽率低而濒临灭绝。正因如此，研究者组装出了染色体水平的牛樟基因组并结合其他10种被子植物和2种裸子植物指明了木兰亚纲的系统发育地位还解析了对开花植物基因组进化问题的疑惑。那么研究采取什么样的策略又是如何进行分析的呢？请随组学君一探究竟。
方法策略
采样（12龄牛樟）
基因组DNA提取（叶片）并测序①Illumina双端测序②PacBio测序（20kb SMRT文库）③构建Chicago和Hi-C文库并进行Illumina测序

RNA提取（花、二期花芽、未成熟叶、幼叶、成熟叶、幼茎和果实）并进行Illumina测序
染色体数目评估
基因组大小评估
基因组从头组装
基因预测和功能注释
基因组杂合度分析
重复元件鉴定
基因家族和同源类群推断以及蛋白域分析
系统发育分析
分歧时间估算
基因组共线性和WGD分析
R基因和TPS基因鉴定
结果概述
牛樟基因组的组装和注释

牛樟预估基因组大小为823.7± 58.2 Mb/1 C， 2n=24。本研究先用PacBio测序覆盖85×深度，reads N50为11.1kb，contig N50为0.9Mb，组装基因组728.3Mb。然后使用141×Illumina reads进行校正，接着用207בChicago’重组染色质和204×Hi-C双端reads进行染色体挂载。最终，整合基因组大小730.7Mb，含2153条scaffolds，占流式细胞仪估算基因组大小的91.3%，scaffold N50达到50.4Mb，占12条对应于牛樟染色体超过90%的pseudomolecules，且注释蛋白质BUSCO评估不低于89%。

基因组特征

杂合位点的空间分布高度可变，有23.9%的基因组每1kb仅有不到1个SNP位点，而有10%的基因组1kb有至少12.6个。杂合区域呈现随机分布，在第11号scaffold上达到最多20.2Mb（参见图1a），但在序列覆盖上较其他杂合区域更均衡，推断与选择性清除、同系繁殖或最近的种群瓶颈效应相关。同时，位于这些杂合区域上的基因在木质素生物合成过程与半乳糖代谢中尤为富集，可能在木质素-碳水化合物复合物的合成中起到作用(见图1b)。

图1 牛樟基因组杂合度(a.每100-kb非重叠窗口的杂合双等位基因的SNPs数目对最大的12条scaffolds作图，Indels被排除；b.使用PSMC方法推断的有效种群大小的历史；c.对每个100-kb非重叠窗口，分布从顶端到末端为基因密度、转录组和三类重复序列。红色T字母表示scaffold末端存在端粒重复簇，LINE表示长散在重复序列 )

转座元件和散在重复序列占到基因组的48%，最大的类别为长末端重复转座子（LTR RT）（25.53%），其次是DNA转座子占12.67%。在LTR RT中，又分别有40.75%为Ty3/Gypsy、23.88%为Ty1/Copia(图1c)。另外，LTR富集的区域较基因组其他区域平均多覆盖了35%，正是其在组装中被折叠导致了流式细胞仪和k-mer分析对基因组大小评估的差异。

再者，染色体水平的scaffolds在染色体中心区域呈现蛋白编码基因密度低、转座元件分布密度高的特点(图1c)。同时研究还发现了687kb核质体类DNA序列（NUPTs），其中96%是小于500bp的短片段。

系统发育分析

研究从上述13个物种中搜寻到了211个单拷贝直系同源数据集，整合为超级矩阵后使用最大似然法进行系统发育树的构建，结果显示木兰亚纲和双子叶植物支系形成姐妹类群关系（见图2）。该系统树在加入额外22个木兰类物种的转录组数据后仍然保持原来的拓扑结构，只是自展支持率较之前稍低。

最后，通过化石年代的标定，研究估算出木兰亚纲和真双子叶谱系于136.0-209.4Ma分化出来，这一结果也得到了最近其他研究结果的支持（图2）。

图2 基于13个物种中211个单拷贝直系同源基因构建的物种系统发育树（+和-旁的数字分别表示基因家族的扩张和收缩；括弧里的绿色数字表示分歧时间的估算；如无额外说明，所有自展支持率为100%）

共线性分析和全基因组复制

研究在72.7%的基因组中鉴定到16498个基因对分布于992个共线性区上，这些共线性区又有72.3%与基因组上超过一个位点呈共线性，也就是说：牛樟祖先发生了不止一次WGD事件（参见图3a）。染色体区域成对的广泛共线性以及每个区域与另外两个基因组片段显著、但非共线性的配对和两轮古代WGD事件息息相关(图3a)。

无油樟（Amborella trichopoda ）是其它现生所有被子植物姐妹类群的唯一物种，自现生开花植物谱系最近的共同祖先分化以来没有发生过WGD事件的证据。因此，研究做了一个假设：两轮WGD事件是牛樟祖先在牛樟和无油樟分化之后发生的，两者基因组的共线性分析发现牛樟1-4个片段匹配上了无油樟基因组的单个区域，证实了上述假设（图3b）。

那么两轮WGD事件什么演化节点上发生的呢？研究者又估算了基因组内和种间的同源染色体Ks(同义替换)分布。牛樟基因组内重复片段峰值在0.46和0.76附近(图4a)，正好和两轮WGD事件对应，研究据此来推断核型进化事件。洛矶山耧斗菜（Aquilegia coerulea）隶属于其它所有现生真双子叶植物姐妹类群的毛茛目，其与牛樟直系同源的分析显示主峰在Ks=1.41左右（图4a），而耧斗菜基因内重复片段Ks=1，由此推断在牛樟和耧斗菜谱系分化后发生了独立的WGD事件。通过挖掘17个樟目和木兰目转录组数据的信息，研究发现樟科Ks分布的两个峰与牛樟Ks分布一致，对应上了牛樟祖先WGD事件的两个基于共线性的推断(图4b和图3)。而其他樟目和木兰目物种仅发现一个Ks峰，推断WGD事件在其演化过程中仅发生一次。在耧斗菜数据中观测到的Ks峰可能对应的是真双子叶植物和木兰亚纲分化后毛茛目内部的WGD事件（图4a）。

图3 牛樟基因组的进化分析（a.牛樟基因组中的637个共线性区基因组内关系示意图；共线性区由五色线条表示，代表祖先染色体组型；紫色区块表示分配到第一种颜色区域上的共线性区；b.牛樟基因组内第一种颜色区域和无油樟对应的共线性关系）

图4 牛樟和其他物种之间同义替换的密度图（a.牛樟与洛杉矶耧斗菜及两者间共线性区鉴定到的成对直系同源重复序列；b.樟科和木兰目基因组内成对重复序列Ks，虚线为在牛樟上观察到的Ks峰，棕色和灰色的线条分别为牛樟和其他樟科Ks分布）

特化木兰亚纲蛋白质组学

研究试图通过对蛋白家族（pfam）域进行注释、评估其在13个用于系统发育分析的种子植物基因组中的分布来鉴定牛樟特有的基因和蛋白域。分析发现，牛樟、真双子叶植物和单子叶植物之间有相当大的重合，说明三个谱系在分化后功能发生了显著的多样化。包括萜烯合成酶（tps）羧基末端结构域在内的蛋白质结构域的获得涉及植物蒸腾效率中的防御反应和富含亮氨酸的重复序列。有意思的是，研究者发现牛樟拥有21个EIL转录因子的拷贝，比之前报道的拥有最多拷贝数的香蕉基因组还多4个；同时EIL是通过激活乙烯应答因子（ERF）来启动乙烯信号应答的，牛樟中的ERF同样高度扩张。通过EILs的扩张来刺激ERF从而实现对下游效应的调控形成了牛樟特有的属性。

接下来，研究还评估了种子植物系统发育中直系同源类群的扩张和收缩。基因家族大小的演化在系统发育过程中是动态的，进化为牛樟的支系没有呈现出显著的扩张或收缩变化。GO富集分析揭示出牛樟不同的基因家族享有共同的功能或者单个基因家族经历了大规模的扩张。

R基因和TPS基因家族

牛樟基因组注释包含了387个R基因模型，其中82%都属于核苷酸结合位点上亮氨酸富集的重复序列（NBS-LRR）或者卷曲螺旋结构的NBS-LRR类型。在13个研究基因组中，牛樟在非栽培植物中含有最多数目的R基因。2465个NBS结构域的系统发育分析也显示基因家族内的分支在真双子叶植物、单子叶植物和木兰亚纲中是独立分化的。引人注意的一点是，牛樟NBS基因最分化的一支与双子叶植物NBS基因最保守的一支形成了姐妹类群。

图5 101个CkTPS基因的系统发育位置

对于牛樟基因组，最显著的特征是其庞大数量的TPS基因（CkTPS）。本研究在牛樟基因组中预测、注释了101个CkTPS，是迄今基因组中发现数目最多的。在加了两个木兰亚纲物种转录组数据并进行系统发育分析后在之前已描述过的7个种子植物TPS基因亚族中明确了6个亚族CkTPS的系统位置(图5和表1)。101个CkTPS基因有7个与催化形成20-碳异戊二烯类化合物的关键酶有关，另外94个很可能编码10-碳单萜合成酶、15-碳倍半萜烯合成酶以及其他20-碳双萜合成酶（表1）。

值得引起注意的是CkTPS基因系统树还解决了TPS-a、TPS-b、 TPS-f和TPS-g基因亚族内部樟科特异性的TPS基因分支。总之，分析表明不论是樟科起源之前还是之后，木兰亚纲TPS基因都处于不断分化之中。

最后研究还分析了不同染色体上TPS基因的分布密度。研究提到，TPS基因在染色体上是不均匀分布的，并且独立亚族中的成员聚类以串联重复的形式存在。在牛樟基因组最大的12条scaffolds上观察到了76个TPS基因，而7号scaffold包含了隶属于多个亚族的29个TPS基因，相比之下，1号scaffold仅含CKTPS-c的两个成员，再有24个CKTPS基因定位在其他小一些的scaffolds上等等。

结 语
本研究涉及的牛樟自19世纪以来遭到过度砍伐，追溯到900万年前，它的有效种群规模其实就在持续下降，这些不仅由于牛樟复杂的种群历史也与台湾的诞生、发展休戚相关，而且还和中新世晚期以及5-6Ma的造山运动脱不开关系。那么本研究最大的贡献在哪里呢？①首次进行了木兰亚纲代表物种的测序，并纳入13个种子植物代表物种的系统发育研究中。虽然金粟兰科和Ceratophyllacae （疑似金鱼藻科）尚无基因组数据可用，但是将牛樟和真双子叶植物归为姐妹类群对于真双子叶植物演化的比较基因组学分析有着重大的意义。②与之前同工酶分析结果相一致，本研究推断出了木兰亚纲发生的两次独立WGD事件的节点，其对病原体、食草动物及其共生交互作用的基因家族的扩张和多样性演化起到了举足轻重的推进作用。③对于核心真双子叶植物六倍体祖先起源的二倍体事件重建，牛樟基因组扮演重要的参考外类群的角色。

④六个被子植物TPS亚族分别进行的基因树拓扑结构揭示了牛樟祖先TPS基因的分化和基因功能，例如证实TPS-f基因亚族在所有被子植物最近的共同祖先中存在但在禾本科中是缺失的等。

⑤研究鉴定了牛樟基因组中101个CkTPS基因并在12条染色体对应的scaffolds上是不均匀分布的且包含来自于多个亚族的基因簇。

简言之，牛樟基因组的问世为揭示其他木兰亚纲物种的遗传多样性和演化打下了坚实的基因组学基础，并对开花植物基因组进化和分化提供了更完善的见解，同时对这种具有重大文化、经济价值的阔叶林物种的多样性保护也起到了作用。

史上最全的ONT碱基识别软件大比拼

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大家都知道Oxford Nanopore Technologies(ONT)是基于单条DNA链通过纳米孔引起电流改变来进行测序的，但是这个过程可不简单！因为噪音信号和随机数据都会干扰碱基读取；而纳米孔的电阻受位于孔最狭窄处的5个核苷酸中的碱基（R9.4）决定，从而有多达45即1024种电波模式，一旦出现碱基修饰如5mc，那么就会有55即3125种电波，因此碱基识别软件（basecaller）在这个过程中至关重要。

现在的basecaller都使用的神经网络算法，且需要用原始的、即包含碱基修饰的DNA进行模拟学习；识别的准确性则由read精确度（单条read对参考数据的相似度）或一致性序列准确度（重叠reads构建的一致性序列对基因组同样位点的序列相似度）来评估，一致性准确度通过增加读取深度来提高。

事实上，read精确度和一致性准确度没有直接的相关性，在错误产生是随机的且读取深度足够深的情况下，低精度的reads也可以产生完美的一致性序列，但如果包含系统错误而不考虑读取深度的话，即使是高精度的reads也可能产生一致性准确度差的序列。

一致性准确度对于基因组组装等需要高深度数据支持的应用来说是关键的影响因素，对读取深度需求较低的应用，则是read准确度显得更重要。

 

鉴于R9.4型纳米孔自2016年十月份延用至今，来自澳大利亚莫纳什大学和伦敦卫生与热带医学院的研究人员想到通过量化R9.4适配的各种碱基识别软件的表现来帮助学者们充分利用ONT电信号，特别是给不知使用自定义数据模拟软件还是新碱基识别软件的用户以参考。研究成果最近发表在了bioRxiv上，和组学君先睹为快吧！

//方法流程//

研究者先是测试了ONT旗下四款碱基识别程序——Albacore、Guppy、Scrappie和Flappie并运行和R9.4reads配套的所有可用版本，另外还测试了一款仍处于研发状态的、基于深度神经网络算法的碱基识别软件Chiron等。

接下来是进行自定义模式模拟，研究者使用Sloika工具包——一种可生成用于Guppy的模式神经网络模拟工具，模拟的数据来自30个不同谱系的肺炎克雷伯菌、10种肠杆菌以及10种蛋白菌。对收集到的5629714条原始reads进行过滤、处理，如去掉短的和低质量的reads等，然后将这些数据修正为不同批次的定量模拟数据，再只用上述软件进行不同模式下的模拟运算。

研究者使用了MinION R9.4芯片来测序原始的肺炎克雷伯菌DNA以测试basecallers的性能，同时也准备了同样样本的高质量Illumina数据以作参考。研究还提取了肺炎克雷伯菌的ONT数据，在使用Guppy进行识别后比对到参考基因组上并排除极低质量和外源reads。除此之外，为了拓宽数据集的范围，研究用到了R9.4和R9.4.1芯片读取肺炎克雷伯菌之外的六种菌种作为测试数据集。

最后就是进行read精确度和一致性准确度的分析了，为评估read精确度，研究使用minimap2将获取到的reads识别数据集比对到参考基因组上计算“BLAST identity”，然后使用Rebaler从这些数据集中生成一致性序列再进行分析。还使用了NUCmer将组装结果比对到参考基因组上对不同的一致性序列错误类型进行分类。

考虑到在组装下游一般都会使用Nanopolish进行数据打磨，那么basecaller的选择是否还那么重要呢？为了得到这个问题的答案，研究者对每一个最终的组装结果都进行了Nanopolish打磨和一致性评估。

//结果概述//

默认模式性能

①Albacore

2017年4月释放的Albacore v1.0.1在均聚物识别上表现良好，而2017年8月释放的Albacore v2.0.1则省去了事件切割（event-segmentation ）步骤直接识别原始信号（图1），这之后的版本表现相对稳定，read精确度为Q9.2，一致性准确度为Q21.9。运行速度约为120000bp/s。

②Guppy

表现与Albacore相当，不过最新版本Guppy v2.2.3在默认模式下的read精确度（Q8.9）上不如一致性准确度(Q22.8)。在使用flip-flop模式时，一致性准确度相当(Q23.0)，但read精确度更佳（Q9.7）。相较其他软件，其在GPU加持下运行速度最快（约1500000bp/s）

③Scrappie和Flappie

Scrappie表现最不理想,Flappie的一致性准确度不如read精确度且速度慢（约14000bp/s）。

④Chiron

Chiron在read精确度上性能不佳（见图1），但Chiron v0.3在默认模式下得到了最高的一致性准确度。最新版v0.4.2亦不如预期。另外，其运行速度为最慢，约2500bp/s。

图1 不同日期释放的每种basecaller版本评测的一致性准确度、read精确度和识别速度。准确度以qscore(Phred quality scores)的对数刻度来表示，Q10=90%,Q20=99%,Q30=99.9%等。

自定义模式性能

和默认的模式相比，在custom-Kp模式（使用了50种菌种的模拟数据）的基准设置下运行Guppy v2.2.3生成的read精确度有了一定的提升（Q9.5），而一致性准确度提升更加显著（Q28.5）（参见图1）。该结果证实了使用分类阶元特异性模拟数据的优势。另外，两种模式下的运行速度相似。

而custom-Kp-big-net在两个方面均有更好的表现，尤其是一致性准确度达到了Q31.6，表明更复杂的神经网络也能够升级结果，只不过速度要略逊一筹。为观察结果对其他基因组是否也适用，研究将可用的Guppy模式也运用于其他的数据集上（参见图2）。结果显示，flip-flop模式相较于默认模式在所有的基因组中都表现更好。而在所有的案例中，custom-Kp-big-net模式得到了准确度最高的read和序列一致性。

custom-Kp模式和custom-Kp-big-net模式都没有使用Guppy的flip-flop模式中存在的新神经网络结构，可以推测：基于flip-flop模式且在自定义模拟数据的模拟下既可以从flip-flop模式也可以从custom-Kp模式中体现优势。

图2 使用Guppy v2.2.3在默认RGRGR模式、flip-flop模式和两种自定义模式下运行各基因组得到的read准确度和一致性准确度。

一致性错误描述

为了探索不同basecallers对各种一致性识别错误的影响，研究者量化了肺炎克雷伯菌基准基因组在Dcm甲基化位点、均聚物以及其他位点上的错误数（详见图3）。结果发现，由于模拟数据中缺少同类信息，ONT basecallers在使用默认模式下对Dcm甲基化位点的识别都不太理想，一致性错误率达到了约0.4%；相反，因模拟数据集中包含了Dcm信息，Guppy v2.2.3在自定义模拟模式下几乎没有Dcm错误（约0.002%）。

除了Dcm模体，错误的均聚物长度占据了大部分的错误（图3）。而ONT的升级则在Albacore上充分体现，不仅一致性准确度有所提升，均聚物的错误也从v.8.4的0.53%降到了v2.3.4的0.13%。同时，最新的Guppy v2.2.3也展现了较好的性能，将均聚物错误降到0.07%。最后，结果还显示对于均聚物，其在custom-Kp模式下表现略逊于默认模式，而custom-Kp-big-net模式则表现最好。

图3 肺炎克雷伯菌基准基因组在不同basecallers下的一致性错误

Nanopolish性能

Nanopolish包含对Dcm甲基化和均聚物特异的逻辑算法体系，能够修正原始信号数据中的一致性序列错误。研究者发现，Nanopolish除了custom-Kp-big-net模式之外，几乎在所有案例中都可以提升一致性准确度（见图4）。分析表明，前Nanopolish一致性准确度和后Nanopolish准确度相关，R2=0.580，这表示即使使用了Nanopolish，basecaller的一致性准确度仍然非常关键。

图4 对肺炎克雷伯菌基准基因组进行Nanopolish之前（红）和之后（蓝）的一致性准确度

因ONT测序平台的便携、经济，其在食源性或其他爆发性病原体DNA碱基替换的检测中有着潜在用途。在本研究中，研究者使用Guppy v2.2.3在custom-Kp-big-net模式下对组装基因组检出的最小替代错误是337个，这差不多是细菌和病原体基因组之间预期的真实SNPs数目的十倍，因此在这类应用中会造成不可估量的高假阳性率。该问题可以通过调用SNP识别策略得到控制，不过基于组装的序列比较则需要识别准确性更高才行。

//研究要点//

1. 从肺炎克雷伯菌基准数据集的read精确度和一致性准确度来看，碱基识别软件Guppy v2.2.3在自定义模式下进行数据模拟得到的结果最佳。这种优越的性能主要取决于对Dcm甲基化的正确处理。因不同物种之间的差异，本研究结论更多的代表一种趋势，那就是当使用相同或亲缘关系足够近（含相似的DNA修饰）的物种DNA进行模拟时，原始的DNA碱基识别准确度是最高的。

2. 对大多数basecallers而言，在默认模式下用于模拟的物种及DNA类型的信息并不是公开的，研究建议软件开发者提供多种模拟模式以供用户选择与研究对象最匹配的一款，同时在条件允许的情况下推荐自定义模式以将碱基识别准确度最大化。以本研究为案例，如神经网络更全面，custom-kp-big-net模式能够获取更精确的结果，但是可能会要耗时一些。

3. ONT自诞生以来在产量和精确度方面均在不断升级，但是仍有上升空间。本研究的模拟结果中最佳的一致性准确度为Q32.2(99.94%的一致性)，可换算为5Mbp的基因组中约有3000个错误，其中很多属于会导致SNP识别假阳性的替代错误。对于完美的细菌基因组而言，标准可预期为Q70即10Mbp中一个错误。目前可采纳的升级方式可以从技术、试剂、basecaller升级或组装后polish工具等入手。因此，在达到预期目标之前，使用Illumina数据混合组装或polish可能对于高精度序列仍是不可或缺的。

未来组2019成果首秀！五谷“元老”庆丰年

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路人甲：组学君组学君，今天和大家聊点啥？组学君：硕鼠硕鼠，无食我黍……路人甲：讲诗经？

组学君：错，今天我们聊“黍”！稻、黍、稷、麦、菽五谷中的黍！

路人甲：那不就是糜子，又叫黄米嘛！

组学君：对！民以食为天，从古诗歌中我们了解到在西周末年到春秋初期糜子就是关乎生计的重要作物，而其最早的栽培史可以追溯到距今七千到一万年前，五谷“元老”名副其实呀！

路人甲：

组学君：最近未来组参与合作的糜子基因组近完成图发表于Nature Communications，当然要细说一番啦！

路人甲：快进入正题吧！

多技术结合打造糜子基因组近完成图[1]

Chromosome conformation capture resolved near complete genome assembly of broomcorn millet (Nature Communications, IF: 12.353)

糜子(Panicum miliaceum L., 2n = 4 × = 36)作为一种古老的作物，具有生长周期短（~60–90d），耐盐碱的特性，尤其是极端抗旱，其耐旱能力甚至比蒸腾系数低于高粱、玉米、小麦的谷子还要强。这种对非生物胁迫的超强耐受性机制一直为研究者所好奇。近日，糜子高质量参考基因组终于问世，该研究由中国农业大学赖锦盛教授团队主导，相关研究文章发表在Nature Communications杂志，从分子角度挖掘了潜藏这一机能的秘密。武汉未来组为该研究提供了PacBio测序及组装。

技术方案 
 
实验材料：Longmi4种子播种14天后（25 °C，暗处理），采集叶片，液氮速冻，提取高质量基因组DNA。

测序方法： 

PacBio、Illumina、BioNano、Hi-C

组装策略：使用Falcon对~170×PacBio长读长数据进行基因组组装，用~116×Illumina短读长数据进行polish，结合~235×BioNano数据辅助构建scaffold，再利用~140.2×Hi-C数据进行模拟染色体构建。

研究结果 
01 糜子基因组的组装分析

研究首先用K-mer分析预估了Longmi4基因组大小约为谷子的两倍，证实了其四倍体化事件，然后基于PacBio和Bionano数据组装出了约848.4Mb的基因组，组装指标Contig N50 达2.55Mb，scaffold N50 达到8.24 Mb，包含了18条super scaffolds，覆盖了~95.6%的基因组（见Table 1）。接着研究通过全基因组测序和RNA-seq数据分别对组装好的基因组进行比对以评估组装的质量，比对率达到了99.6%和91.5%，说明组装质量非常好；经BUSCO评估发现基因完整度高达98.0%，标明组装完整度和准确度都非常高！

最后，精益求精的研究者还将Hi-C数据纳入其中以将scaffolds锚定、排序，通过深度约140.2×的覆盖将444条scaffolds装出了19条超长scaffolds以进一步分析。研究发现Longmi4染色体内Hi-C互作矩阵中出现明显的反对角图案(Fig. 1a)，反映出所谓的染色体Rabl构象（间期染色体长短臂平行折叠）。基因组比较分析揭示了糜子和谷子之间的2对1的共线关系(Fig. 1b)。与玉米基因组不同，糜子的染色体在基因组四倍化后并未发生明显的融合现象，但染色体内的重排尤其是倒置现象在糜子基因组中广泛存在。例如在pm5和pm8两条染色体上，就有两个大小约为11.8 Mb和8.9 Mb的区域发生了倒置(Fig. 1b)。同时，研究者还发现pm3、pm10、pm14和pm15号染色体末端的一致性，它们之间是两对同源染色体，由此推测这对染色体末端之间的交换应是发生在糜子基因组四倍化之前。

Fig. 1 Hi-C技术辅助构建Longmi4模拟染色体

（a）200kb分辨率下的Hi-C互作热图

（b）糜子(pm1–pm18)和小米(si1–si9)基因组比较

02 基因注释和基因家族分析

通过结合~68.6 Gb的RNA-seq数据及一些近缘物种的蛋白序列，研究者在糜子基因组中预测出63,671个蛋白质编码基因，其基因数量几乎是谷子基因数量（34,584）的2倍。基因组比较分析发现，糜子和谷子共有19,609个基因，在这些基因中，有16,884(~86.2%)个基因在糜子基因组中都拥有两个同源拷贝，表明在发生全基因组复制事件(WGD)之后糜子基因组中丢失的基因较少(Fig.2 )。

Fig.2 以小米基因组为参考分析糜子基因组中的基因丢失与保留

通过对糜子基因组的深度挖掘，研究者揭示了糜子基因组中与抗生物胁迫和非生物胁迫的可能相关基因。共鉴定出493个含有NB-ARC结构域（可能与抗病性有关）的基因，其中20个基因(7个基因家族)在糜子中具有特有。与珍珠稷类似，糜子中的含NB-ARC结构域的基因具有一定的偏向性，主要集中在pm13和pm18染色体末端（Fig.3）。同时，糜子作为典型的耐旱植物，在其基因组中鉴定出了15 个ABA 或WDS应答基因。

更重要的是，与一般ABA基因的诱导表达不同，这15个ABA基因中有四个基因存在持续表达的表达谱，充分暗示了这些基因可能参与了糜子的极端非生物胁迫抗性。

Fig.3 NB-ARC结构域基因在糜子的18条

模拟染色体上的分布情况

03 Gypsy元件的近期大爆发

研究者发现在糜子基因组中~54.1%的序列为重复序列，其重复度在谷子和珍珠稷之间（二者基因组重复序列含量分别为~46.8%和~68.0%）。与其他谷物类似，LTR反转座子尤其是Gypsy超家族是糜子基因组中最主要的重复元件（Gypsy超家族占比~31.4%）。研究者对包括糜子在内的5种作物中的Gypsy和Copia家族的插入时间进行了分析，发现玉米和高粱中Gypsy元件在近期有一次爆发，其他三个物种的爆发时间较早，但都发生在距今~100万年以内(Fig.4a)。相比之下，糜子基因组中的Copia家族的爆发时间要早得多，大约发生在距今200万年前(Fig.4b)。

Fig.4 糜子 (P. miliaceum)、谷子 (S. italica)、珍珠稷 (P. glaucum)、高粱 (S. bicolor)、 玉米(Z. mays)基因组中的Gypsy (a) 和Copia (b)的插入时间分析

04 黍亚科大类黍族的进化分析

研究利用组装的高质量的糜子基因组、新发表的珍珠稷基因组和Dichanthelium oligosanthe基因组进行联合分析，构建了黍族系统发育树（Fig.5）。系统发育分析揭示了糜子的异源四倍体化发生在591万年之内，而糜子和谷子的分化大约发生在1310万年前。

Fig.5 黍族的系统发育分析

结 语

本研究所报道的高质量糜子基因组序列不仅对理解糜子基因组四倍体化后的动态进化具有重要意义，而且对今后的糜子分子育种也有一定的参考价值，并将促进黍属植物与其他作物的比较基因组研究。

同时，研究结合了三代长读长全基因组测序技术、二代短读长测序技术、Bionano光学图谱、Hi-C染色体构象捕获等技术优势，获得了高质量的糜子基因组，说明了多组学平台的结合对于复杂程度高的作物具有显著的优势。近年来，不断有高等植物通过该手段获得了良好的组装质量，如武汉未来组2018年参与的玉米基因组文章[2]借助PacBio辅以Illumina、Bionano技术登上了Nature Genetics，Bionano光学图谱已成为破解作物遗传密码的首选秘密武器。还有借助Hi-C技术登上Science的小麦[3]和其他作物如日本晴[4]、苦荞[5]等，可以说杂合、重复已不再是基因组难题，对于它们基因组的解析在分子育种、农业生产以及特性优化方面都有着不可估量的价值。

 

延伸阅读：

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参考文献

[1] Junpeng Shi, Xuxu Ma, Jihong Zhang, et al. Chromosome conformation capture resolved near complete genome assembly of broomcorn millet[J]. Nature Communications, 2019.

[2] Sun, S. et al. Extensive intraspecific gene order and gene structural variations between Mo17 and other maize genomes. Nature Genetics (2018).

[3] Avni, R., Nave, M., Barad,et al.  (2017). Wild emmer genomearchitecture and diversity elucidate wheat evolution and domestication. Science, 357(6346), 93-97.

[4] Dong Q , Li N , Li X , et al. Genome-wide Hi-C analysis reveals extensive hierarchical chromatin interactions in rice[J]. The Plant Journal, 2018.

[5]Zhang L , Li X , Ma B , et al. The Tartary Buckwheat Genome Provides Insights into Rutin Biosynthesis and Abiotic Stress Tolerance[J]. 分子植物：英文版, 2017, 10(9):1224-1237

Cell| PacBio升级解析人类基因组结构变异

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继登顶Nature后，近日，PacBio文章再度收录于顶级期刊Cell上！第三代测序技术的实力日渐凸显，这次又在哪个领域有所突破呢？原来，华盛顿大学医学院的Peter A. Audano等人瞄准了当前人类基因组注释中的缺陷，试图用长读长技术修复人们对SVs认知的误差，下面和组学君先睹为快吧！
 一句话搞定？
长读长测序技术助力人类SVs分类解析并促进短读长数据对其进行基因分型的算法研究，明确了SVs在人类基因组研究中的重要作用！
 一张图说明？

 一分钟看完？ 

为了优化人类结构变异（SVs）信息，研究者对15个人类进行了长读长测序并且分析了SVs，最后找到了99604个插入、缺失和倒位，其中2238个（约合1.6Mb）为已揭示的人类基因组中所共有，另外还有13053个（约合6.9Mb）在大多数人类基因组中找得到，证实参考基因组中含次要等位基因或者错误。附加的440个基因组分型结果证实了特异染色质中最常见的SVs被解析出来。研究发现：人类染色体最末端的5Mb中所包含的SVs是其他位置的9倍之多，其中55%的可变数目串联重复序列都映射到该区域。研究者鉴定出影响编码和非编码调控位点的SVs，优化了注释和对功能变异的解析，为精细人类参考基因组图谱构建了框架并为捕获等位基因多样性提供了重要信息。

如果有时间慢慢读，请继续……

材料与数据

该研究使用PacBio长读长测序技术对11个人类基因组进行测序，然后添加了两个之前已由本研究测序过的葡萄胎（胎盘绒毛发生良性病变的胚胎）CHM1和CHM13。另外，还加入了由未来组参与的华夏一号HX1以及同样是16年发表的亚洲人AK1基因组数据（见表1）。

深度挖掘SVs
对每一个人类基因组样本使用SMRT-SV鉴定、组装出50bp或者和GRCh38关系更密切的插入、缺失以及倒位SVs，且排除不可靠的SVs calling结果，如具有密集串联重复或间隙结构的着丝粒周围区域。最后平均每一个样本中鉴定到22755个SVs，且将它们融合为一个99604个非冗余SVs数据集（见表1和图1A），并分为四大类别：共有的、主要的（≥50%但并非所有样本中存在）、多态的（多于一个但＜50%样本中存在）以及特异的SVs。

图1A 使用非冗余策略融合每个样本的变异成一个数据集

和预期一致，非洲样本多态性最丰富，平均每一个非洲人样本贡献了11.1%的特异性SVs，而非非洲人样本平均是5.6%，可以推断加入非洲样本可以将SVs识别翻倍（见图1B）。

图1B 每个样本中每一个分类类别的变异数量

非冗余数据集起初增长急剧，但是随着样本增加，增速放缓，这也说明这15个人中共有的SVs比例较高。同样，共有SVs数据集一开始降低急剧，随着样本增加逐渐平缓，所有样本中共有的SVs是2238个，且携带每一个SV的样本比例也呈现类似模式，共有的SVs增加了100%。同时，研究鉴定出15291个主要的SVs，表明当前的人类参考基因组在这些位点上中也含有次要等位基因或者错误。相较于多态SVs，主要变异数量更多且倾向于在重复DNA（约占80%）中富集。当与GRCh38基因组进行缺失比较的时候，如分析样本中共有SVs比例更高则定义其为插入SVs（见图1C）。

图1C 插入（INS）、缺失（DEL）和倒位（INV）三种变异在各类别中发现的频率

有意思的是，研究还和Illumina测序的人类基因组数据SVs识别结果进行了比较，发现本研究使用长读长测序技术挖掘出了87.3%的SVs在之前的二代测序数据中没有找到，尤其是插入SVs，有93.5%是之前不曾鉴别到的，其次是缺失SVs，新发现的比率也很高。这再一次证明：第三代长读长测序技术较之第二代短读长测序技术能够鉴定到更多的SVs。当然研究还将结果和人类基因组结构变异联盟做了比较，因篇幅限制就不详述了。

附加人类基因组的基因分型
为更好的理解SVs的群体分布，研究者优化了基因分型工具SV genotyper并应用于使用Illumina数据构建的440个人类基因组上（图1D）。结果显示，在至少95%的样本中，55.1%的SVs成功地进行了基因分型，92.6%的SVs成功地进行了一半或更多的基因分型。在那些能够成功进行基因分型的基因中，我们观察到至少一个附加人类基因组中有97.2%的SVs。这表明绝大多数SVs代表真正的人类多态性，而不是个体变异或体细胞伪影。

图1D 440个人类基因组样本中可分型的SVs其不同类别的出现频率

与预期的一样，在共有的和主要的SVs中分别找到了95.4%和66.7%的次要等位基因。在本研究中发现的507例（0.74%）共有和主要SVs中，研究者只观察到替代等位基因，却未观察到任何人类参考基因组序列。对于这些基因位点，人类参考基因组要么代表一个极端次要的等位基因（<0.2%），要么就是错误。

SV密度和染色体分布

SVs在基因组中是非随机分布的，研究者观察到在重复片段富集的染色体臂末端5Mb区域内，SVs呈现明显的偏倚（见图1E），并且推断亚端粒区域，SVs的密度是其他区域的9倍！共有SVs偏倚要小一些，但仍有3倍的密度差。

图1E  将SV划分为500Kb的bins并在不同染色体臂距离上进行聚类

当研究者在人类染色体中发现这一现象时，这些SVs却不是均匀分布，尤其是染色体长臂端更倾向于出现SVs亚端粒聚集，不过5号、19号以及X染色体是例外。研究者为了深入分析SVs偏倚这一现象，对其重复类型分类检验其亚端粒上的富集情况。他们观测到：SVs在VNTR上的富集密度是其他区域的4.8倍，其次是STRs（短串联重复区域），为2.9倍（见图2A）。

图2A SVs在STR和VNTR位点上的分布密度

虽然不同染色体富集情况不一，但是相较于短臂，人类染色体长臂上SVs普遍呈现出更宽区域的VNTR富集（图2B）。

图2B VNTR在不同的染色体臂距离上的聚集比率

另外，研究者还观察到双链断裂和VNTR密度之间的显著相关性，强烈的暗示了容易出现双链断裂的区域和VNTR形成之间的关系（图2C）。

图2C STR和VNTR数和双链断裂数相关性

基因的和潜在的调控SVs

接着，研究者又将共有的和主要的SVs和RefSeq注释结果交叉分析，解析了86个影响编码序列的事件、47个UTRs（非翻译区）事件、7417个内含子或任何基因2Kb空白区域中的事件。另外，还特意鉴定了1033个影响推断的非编码调控序列事件，本研究中定义为注释了的DNase I hypersensitive、H3K27Ac、H3K4Me1以及H3K4Me3位点的联合（见表2）。

这些事件中的许多嵌入了GCRICH或低复杂度DNA的区域，并可能影响基因结构。以图3A为例，在UBEQ2L1的5’端，研究者鉴定了一个1.6 kb的插入，主要由94 bp 富含GC的序列附近的二核苷酸和三核苷酸CACA重复单元组成。插入的断点精确地map到5’ UTR的第一个碱基，很可能扩展了UBEQ2L1启动子的长度。富含AT的序列照样可以被解析，例如458 bp重复元件在载脂蛋白APOOL 3’UTR内map上（见图3B）。

图3 缺失的基因或调控序列（部分）

优化mapping和SVs挖掘
基因组注释的优化以及对人类单倍型结构差异的理解深度对SVs的发现、解析具有重要的影响。在30个Illumina WGS样本中，研究发现如果将SV contigs添加到人类参考基因组及其替代contigs上，可以找到之前2.62% unmapped的reads，且有1.24% map到这些contigs上的reads提高了mapping质量。甚至，这些新map到的reads促使了插入SVs间SNVs和插入缺失的发现。例如，研究者使用GATK HaplotypeCaller鉴定到21969个特异变异，含68656个替代等位基因。通过短读长测序技术或者简单的线性参考基因组无法确定这些SVs，当缺失的序列映射到了编码序列时，这之间的差异直接影响对SVs的解析。举例说明，研究者鉴定到了FOXO6 exon 2上200bp的插入，而这200bp的片段与海马记忆加强和树突状脊柱密度紧密相关（见图4C）。恰恰这一片段在RefSeq以及Ensembl基因注释上都是缺失的，第二个（及最后一个）外显子在该插入的位点被分离了：RefSeq将外显子结合到一个0bp的内含子以及1391bp片段的第三位外显子上，而Ensembl则将它们接合到一个1bp的内含子以及477bp片段的第三位外显子上。本研究分析发现包含这200bp片段的序列形成了一个连续的编码外显子，加了67个氨基酸到ORF（开放性阅读框）上，相较于RefSeq注释，改变了基因终止密码子的位点。基因组突变频率数据库（gnomAD）报道了FOXO6上发现的7个功能缺失（LoF）的SVs，本研究通过纠正FOXO6阅读框，将两个推断的LoF变异正名为同义SNVs，还有一个更正为3’UTR中的SVs（见图4D）。

图4 纠正FOXO6阅读框

除了上述分析内容，本研究还分析了共有的和主要的等位基因SVs的特性、偏向性的GC组成并对人类参考基因组进行了补洞，对SVs进行了表达分析等，感兴趣的话可以阅读原文一探究竟。

总之，文章有如下几大亮点：

1. 测序注释了99604个常见的人类结构变异；

2. 发现了55%的可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats, VNTRS)映射到染色体末端，经分析其与双链断裂有着密切关联

3. 发现长读长测序技术能够鉴定到更多的SVs，尤其对于编码序列，SVs识别更加准确

4. 完善了参考基因组并为人类泛基因组研究丰富了多样性

原文内容博大精深，详情请点击原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)31633-7

相关阅读：

https://www.grandomics.com/research/h_x_w_r_sv/

SVs识别哪家强？PromethION为您揭晓

一滴蚊子血克隆出恐龙太扯？嗯，克隆出这只蚊子没毛病！

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经典好莱坞大片《侏罗纪公园》相信小伙伴们还记忆犹新，斯皮尔伯格拿一只唯一不会吸血的还是只公蚊子当道具实在是功课没做好——不过也有技术宅质疑，如此微量的血液真的足够克隆出一个庞然大物？那么问题来了，基因组测序到底需要多少样本量？科学怪蜀黍要克隆出来自侏罗纪的蚊子，一只不够吧？
PacBio告诉你——完成全基因组测序，一只蚊子的DNA够够的了！

近期 Wellcome Sanger 研究所和 PacBio 公司的科学家公布了一种新的利用低起始量样本DNA进行全基因组测序的protocol，仅输入100ng DNA即获得了高质量的科氏按蚊基因组de novo组装效果。下面让我们通过预印版文章抢先来看看这一protocol到底特别在哪里吧！

材料：一只雌性按蚊（Anopheles coluzzii）

HMW DNA提取：

在200μl PBS中捣碎虫体，使用Qiagen MagAttract HMW kit (PN-67653)试剂盒提取基因组DNA，并作如下调整：将Buffer ATL替换为200ul 1X PBS；在组织匀浆和孵育之前将PBS与RNAse A、蛋白酶K、Buffer AL混合；孵育时间缩短至2h；轻击管壁混匀；清洗1min；提取过程中转移DNA均使用宽口tips；

这些调整与10×genomics基因组提取方法一致，目的在于获取>50Kb的基因组DNA分子。结果显示，通过此法获得的gDNA总量约为250ng,且DNA长度主要分布在~150Kb左右。但经过低温运输过程之后，部分gDNA发生降解（Fig.1）；使用Qubit fluorometer检测DNA浓度，随后使用其中的100ng DNA进行文库构建。

文库构建：

1 使用SMRTbell Express Prep kit v2.0构建SMRTbell文库（由于大部分基因组DNA已经片段 化至20Kb以上，因此省略gDNA剪切步骤）
2 对100ng DNA进行第一次酶促反应，除去单链突出端
3 随后用对DNA链进行损伤修复；
4 双链DNA末端加A；
5 于20°C条件下连接含T末端的SMRTbell接头（此过程耗时60min）；
6 使用AMPure PB bead 进行SMRTbell文库纯化：
①首先使用0.45X AMPure②随后使用0.80X AMPure；
③最后使用FEMTO Pulse及Qubit Fluorometer对最终的文库进行浓度及大小检测（Fig.1）。

Fig.1 Anopheles coluzzii gDNA及最终文库

SMRT测序：

测序引物版本v4.0；聚合酶v3.0；使用Sequel系统测序，测序试剂版本v3.0，运行时间1200min；软件版本v6.0；共测序3 个SMRT Cells。

数据产出：平均25 Gb /SMRT Cell (20 h movies)

组装指标：使用FALCON-Unzip软件进行de novo组装，contig N50 3.5 Mb，基因完整度大于98%

 操作要点: 
  • 基因组提取过程轻柔操作，保留大片段高质量DNA；
  • 建库过程不经历DNA剪切及片段筛选过程，避免剪切、纯化等步骤对DNA带来的损失，尽可能的保留DNA。

怎么样？这么省样品的建库测序方法你get了吗？据悉，这一新的官方protocol将于2019年2月正式发布，届时，PacBio必将在一些典型的涉及低DNA起始量的领域大展拳脚，如小生物膜的宏基因组分析、穿刺样本中分离的DNA样本、及需要有限扩增的靶向测序和单细胞测序等应用。

武汉未来组早在2016年就已经成功搭建基于PacBio的三代测序平台，并于2017年9月成功搭建Nanopore测序平台，一直致力于第三代测序技术的应用和推广，应用三代测序的合作研究成果多次登上Nature Genetics、Molecular Plant及Nature Communications等国际知名期刊。三代测序首选的合作者是谁？当然是未来组啦！

参考文献：

Kingan, Sarah, et al. “A High-Quality De Novo Genome Assembly from a Single Mosquito using PacBio Sequencing.” bioRxiv (2018): 499954.

Science首秀！看Nanopore如何杠上拉沙热病毒

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过去三年，

有一种病毒疯狂肆虐

几内亚（科纳克里）、利比里亚、

塞拉利昂和尼日利亚部分地区！

2018年，

更是一发不可收拾！

截止2018年3月，仅尼日利亚

疑似病例就达1495例！

不排除其它西非国家存在的可能…

拉沙热听过？

一种主要通过动物传染的病毒性出血热疾病，

一旦感染，人畜共患！

Fig.1 2018年1月1日-3月18日拉沙热确诊病例分布图。(A) 受影响国家；（B）测序样本来源（橙色标记）

拉沙热病毒（LASV）是一种RNA病毒，且基因组高度可变，L区段（基因组大片段，编码RNA聚合酶和锌结合蛋白）和S区段（基因组小片段，编码糖蛋白和核蛋白）的种间核苷酸变异高达32%和25%，很难用短读长扩增子测序的方法准确检出。

怎么办？不忍看到水深火热中的西非人民继续遭罪，英格兰公共卫生署的Liana Eleni Kafetzopoulou及其同事们想到了纳米孔测序技术。对了，就是一种比U盘大不了多少的MinION纳米孔测序仪，通过对36个基因组及120份临床样本进行实时宏基因组测序分析，帮助他们揭示了LASV的多样化及其与早期发现的毒株的系统发育相关性，研究成果于2019年1月4日登上Science杂志——学者仁心，大大的赞！

Fig.2 样本测序时间轴

研究者调取了120份LASV-阳性临床样本，7周内搞定测序（Fig.2）。为了弄明白产生病毒间的亲缘关系，研究者将basecall reads和原始信号数据映射到参考序列上，使用Nanopolish进行突变体检测。对于非人源序列，研究者用canu进行了de novo组装，平均每个样本中包含LASV序列4.26%—42.9%，组装出了可以对91个样本中至少一个直系同源片段进行系统发育构建的矩阵。

研究者还留了个心眼，用Illumina测序对14个SISPA文库测序进行验证，发现Nanopore与Illumina序列高度一致，所以三代测序就是这么牛，靠谱，还走哪带到哪（Table 1）。

研究采用Centrifuge软件对110号样本进行宏基因组分类，鉴定出其中0.10%的reads源自甲型肝炎病毒，20×的测序深度达到了74%的基因组覆盖率。在同一个样本中，LASV reads占到了0.83%，达到了96%的基因组覆盖率。说明啥？嗯，哪怕多个长得很像的RNA排排站，Nanopore都能火眼金睛，一眼看穿——那些作为混合感染存在的病毒也无一例外！

那么，2018年尼日利亚拉沙热爆发的分子流行机制又是怎么回事？

别急，研究者使用生成的LASV序列及一些已有序列构建了拉沙热病毒系统发育树，真正的寻根溯源！基于S区段的最大似然法构树显示：2018年的LASV毒株都归属于尼日利亚LASV变种，尤其是Ⅱ型和Ⅲ型（Fig.2）。这个结果与基于L区段构建的系统发育树仅有7个毒株不一致。最后，真相大白：啮齿动物宿主污染是2018年拉萨热爆发的主要原因。所以奉劝小伙伴，没事零食别到处乱扔……

所以说，纳米孔测序技术在宏基因组学研究及疾病传播研究中的价值不容小觑，再加上实时测序、快速分析等其他技术无可比拟的优势，真的可以造福人类。这个研究缓解了人们对拉沙热在人际间广泛传播的恐惧，使公共卫生资源得到了合理分配，还指出LASV防治重点是加强社区鼠类控制、环境卫生和食品储存安全。

参考文献

Kafetzopoulou, L. E., Pullan, S. T., Lemey, P., Suchard, M. A., Ehichioya, D. U., Pahlmann, M., … Wozniak, D. M. (2019). Metagenomic sequencing at the epicenter of the Nigeria 2018 Lassa fever outbreak. Science, 363(6422), 74–77. doi:10.1126/science.aau9343 

辞旧迎新贺岁篇|走出非洲，人类基因组丢了10%？

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人类基因组约3Gb，也就是30亿个碱基，如果将所有碱基排印成书，那么厚度将超过100米[1]。自从1977年测序技术诞生以来，人们已经推开了生命的奥秘之门，如今，又将好奇的目光投向人类自身。地球46亿年的漫长岁月，已有35亿年的生命史，而人的出现才几百万年。怎样定义人？人类是从地球孕育而来吗？人可以永生吗？人的终极演化形态是怎样的？也许有一天，这一切都可以从人类基因组中找到答案。

许多年以后，面对曾经科幻片[2]里才有的万能医疗舱，人类一定会想起他们第一次宣布HGP启动的1986年。

生命之书卷帙浩繁

——测序技术敲开人类基因组大门

1990年，在经过长达四年的争论和筹划后，人类基因组计划（HGP）终于获批启动，计划15年内完成绘制分析，投入资金30亿美元。

2000年，国际人类基因组测序联盟与Celera公司联合发布了基于全基因组鸟枪发测序的人类基因组草图，在2001年成果分别见刊Nature和Science杂志[3-4]，发现人类基因数目仅3-3.5万个左右。值得一提的是，中国作为六个参与国家中唯一的发展中国家，测定3116Mb的序列，即完成了人类基因组的1%，精度达到了99.99%[5]。问题是，常染色质序列覆盖度只有90%，且序列之间存在近15万个空缺，导致了早期建立的很多基因模型是错误的。

2003年，中、美、英、德、日、法六国宣布比预期提前了两年完成了人类基因组序列图并于2004年发表在Nature上，进一步压缩人类编码蛋白的基因到2-2.5万个，精度达99.999%[6]。相较于2001年，常染色质的空缺只有341个，在这前后，研究者们也陆续将性染色体注解出来。

2005年，我国参与度达10%的人类单体型图谱问世[7]。

2006年，基因含量最多、解码难度最大的1号染色体登上Nature[8]，标志着HGP的传奇乐章画上了休止符。

探索奥秘从未止步

——第二代测序掀起测序行业革命

2007年全球第一个白种人基因组图谱的公布标志着个体基因组时代的来临[9]。很快，深圳华大基因研究院就骄傲的宣布：第一个亚洲人基因组图谱“炎黄一号”发表于Nature[11]，覆盖了36×的深度，拿到了一千一百七十七亿碱基对，比对了NCBI人类相关基因组，短reads序列达到99.97%覆盖率，而且根据参考的基因组，研究人员利用唯一的mapped reads获得了一个92%亚洲个体基因组的高质量序列集合。同时研究人员从中识别出了大约300万个SNPs，其中13.6%在dbSNP数据库中没有出现过，基因型分析证明这些SNP具有高精确性和一致性。研究人员还将这些序列与另外两个个体基因组(J. D. Watson and J. C. Venter)进行了比较，证明了第二代测序技术在个人基因组方面的应用潜力[12]。得益于第二代测序技术的高通量，整个项目不过一年时间，耗资1000万人民币！这项里程碑式的成果对中国以至整个亚洲人的治病基因、疾病预测等研究都有着非同寻常的意义。接着，第一张女性个人基因组图谱、第一张非洲人基因组图谱也相继出炉。但是第二代测序技术读长比重复元件要短，而人类基因组中已知的重复序列和片段化的重复元件占了近一半，这就导致在拼接的时候难免遗漏很多重要的信息。

 2008年炎黄一号首张中国人基因组 图谱登 《Nature》封面

技术革新再创辉煌

——第三代测序助力人类精细图谱问世

第三代测序技术以单分子测序且读长超长著称，因无需PCR，所以几无测序偏好性，由于荧光基团并不是附着于碱基而是磷酸键之上，大大降低了测序过程中的三维阻力，再加上ZMW孔锁定荧光检测区域，使读长远超二代测序。

通过PacBio SMRT，未来组助力暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院主导的亚洲人参考基因组“华夏一号”收录于Nature Communications[10]。

“华夏一号”基因组组装策略结合了PacBio SMRT单分子实时测序技术和BioNano光学图谱分析技术，从头组装得到2.93G基因组，Contig N50为8.3Mb，Scaffold N50为22Mb，得到一个中国人个体的基因组接近完成图。

图2 相较已发布人类参考基因组，“华夏一号”的Contig N50有将近10倍的提高

研究者还发现PacBio数据可以轻松跨越从5’末端到3’-Poly A tail的完整转录本，从而准确鉴定异构体，并对可变剪接、融合基因、等位基因表达等进行精确分析。在对Illumina和PacBio的测序数据的覆盖率比较后发现PacBio数据不受GC含量高低的影响，所以可以覆盖到多Illumina数据覆盖不到的区域，所以在基因组组装上优势就很明显。

图3 a.PacBio数据对GC含量异常区域覆盖更均匀，b.PacBio覆盖到Illumina覆盖不到的区域

“华夏一号”的发布填补了中国人群的疾病研究缺少精细参考基因组的不足，并将推进临床和科研大数据应用的重要基础性工作，大力推动中国的遗传疾病研究与诊断的发展。

第三代测序技术不仅有PacBio，更有人类历史上首次实现的纳米级别、也是唯一一种通过电信号的波动进行测序的技术Oxford Nanopore Technology（ONT），如2018年Nature Biotechnology上就发布了使用ONT首次高精度解析人类Y染色体着丝粒的研究[13]。

开拓视野解码升级

——非裔泛基因组补充10%人类DNA

最新的GRCh38基因组只有875个gaps[14]，虽则如此，研究者们的目光多是聚焦在单个人身上，这样无疑滞碍了混血群体的研究，例如非裔人群。

近期，有约翰斯·霍普金斯大学的研究者使用全基因组鸟枪法测序法深度测序了910个非洲人种，构建了人类参考基因组中缺失但却在这910个非洲人中共有的DNA序列集，并鉴定出非洲人泛基因组在参考基因组中缺失的区域，最后发现了125715个特异contigs相当于比人类参考基因组多出超过约10%的DNA。研究者揭示出其中387个contigs来自315个特异的蛋白编码基因，余者来自基因间区域。这一研究成果发布在Nature genetics[15]上。

在这份研究中，研究人员收集了来自910个非洲人后裔群体的基因组，横跨全球20个地区包含美国、中非和加勒比等地的CAAPA（美洲非裔群体哮症协会）成员，使用Fig.1图示步骤去除了污染及冗余的contigs，最后鉴定到了GRCh38基因组中缺失的296.5Mb共125715条新序列，并且研究者将其中1548条序列（4.4Mb）锚定到了GRCh38基因组上的特异位点上，平均每个个体包含了859条插入序列，其中有一条序列同时可以在六个个体中找到。1548条序列中的302条完整定位到了基因组中的位置并解决了剩下1246条序列插入末端的断点。最长的定位到的序列为79938bp，存在于在197个样本中，而最长的未定位到的序列为152806bp，存在于11个样本。所有定位到参考基因组上的序列中的387条与已知基因相交，48个特异基因在外显子上，另外267个基因属于内含子区域；其中315个基因含插入序列，其中292个被命名（非“假设”或无意义的鉴定）。研究组装出的contigs中的31354079个碱基可以比对到GRCh38基因组上（一致性≥80%），组装成单个基因组后可以匹配上60202871个碱基(一致性≥80%)。

另外，研究还将该研究中的125715个泛基因组contigs比对到未来组参与完成的华夏一号（HX1）基因组和韩国人基因组（KOREF1.0）上，发现有42207个contigs共120.7Mb可以比对到韩国人或华夏一号基因组上且一致性≥90%，覆盖度≥80%，优于对GRCh38的匹配度，其中一个区段的示例见表1和图4，这个发现表明生成GRCh38基因组的个体缺失了一部分序列。

表1 非裔泛基因组contigs和华夏一号及韩国人基因组的比较

图4 将非裔泛基因组和华夏一号、GRCh38基因比对

Shi et al等人于2016年组装的华夏一号基因组报道了12.8Mb的新DNA，研究者则发现华夏一号和该研究中生成的特异序列共享68.1Mb的DNA。总之，该研究发现，亚洲人泛基因组产生的序列中有296.5Mb相当于10%的基因组大小在标准人类参考基因组中是缺失的，这其中有120.7Mb可以在韩国人或者华夏一号基因组中找得到，间接表明这些DNA代表的基因区域在GRCh38基因组所代表的群体中于更近的时期丢失了或者十分罕见，也可以说明单个参考基因组不适宜基于群体的人类遗传学研究，将来或许会有更好的方法获取综合性的人类泛基因组，捕获所有人类中的DNA。

随着“中国十万人基因组计划”、“地球生物基因组计划”的相继问世，人类仍在组学研究的大潮中寻找属于自己的那朵浪花，现有的成果距离揭示人类的奥秘还有很长的路要走。武汉未来组有幸也成为了一名弄潮儿，由未来组发起的“个人参考基因组服务计划”、“华夏万人结构变异计划”正在如火如荼的进行，并且进展顺利。人的智慧无穷尽，探索的脚步永不停，总有一天，人们只需要带着自己的基因图谱去看医生，扫描一下数据就可以直达病灶，然后躺进万能的医疗舱，出来的时候百病全消……

辞旧岁，迎新年，在这里，组学君默默祝祷，期望每一个善良的人都平安喜乐，百病不生。在新的一年，未来组将创造更多的成绩回馈社会，回馈组学领域，也祝愿每一位科研工作者硕果累累，万事如意！

已发表精细人类基因组图谱[10，16]

2018年NCBI上收录的人类基因组组装版本[17]

参考文献

[1]http://jiyongqing.blogchina.com/2427017.html

[2]《第五元素》、《极乐空间》、《普罗米修斯》等好莱坞科幻影片中均出现过能够复原生命或者治疗人类疾病的医疗舱。

[3]International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860–921 (2001).

[4]Venter, J. C. et al. Te sequence of the human genome. Science 291,1304–1351 (2001).

[5]骆建新, 郑崛村, 马用信, et al. 人类基因组计划与后基因组时代[J]. 中国生物工程杂志, 2003, 23(11):87-94.

[6]Finishing the euchromatic sequence of the human genome[J]. Nature:931-945.

[7]A haplotype map of the human genome : Article : Nature[J]. Nature, 2005.

[8]Gregory S G , Barlow K F , Mclay K E , et al. Corrigendum: The DNA sequence and biological annotation of human chromosome1[J]. Nature, 2006, 441(7091):315-321.

[9]高媛. 后基因组时代的生物信息学发展[J]. 中国科技信息, 2009(10):225-226.

[10]L. Shi, et al., Long-read sequencing and de novo assembly of a Chinese genome. Nature Communications (2016)

[11]The diploid genome sequence of an Asian individual[J]. Nature.

[12]https://m.antpedia.com/news/49844.html

[13]Jain M, Olsen H E, Turner D J, et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome[J]. Nature biotechnology, 2018.

[14]Schneider, V. A. et al. Evaluation of GRCh38 and de novo haploid genome assemblies demonstrates the enduring quality of the reference assembly. Genome Res. 27, 849–864 (2017)

[15]Sherman， R. M. at al. Assembly of a pan-genome from deep sequencing of 910 humans of African descent. Nature Genetics.51, pages30–35 (2019)

[16]De novo assembly and phasing of a Korean human genome. Nature 538,243–247 (13 October 2016) doi:10.1038/nature20098

[17]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/organism/9606/latest/

【年末精选】当转录组遇上三代测序

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每一项科学研究都是为了解决科学问题，那么当转录组研究遇上三代长读长测序技术，又能讲述怎样有趣的科学故事呢？

蜂鸟如何实现高效的能量转换？
15 February 2018, GigaScience

蜂鸟是唯一一类需要通过持续飞行获取花蜜的鸟类，其中的红喉蜂鸟，其在飞行中的高效率能量代谢几乎可与脊椎动物相匹敌。蜂鸟利用摄取的花蜜来为飞行提供能量，在这个过程中，蜂鸟体内流动的糖分是不飞行的哺乳动物体内的55倍。但糖类并不是唯一的能量来源，在长时间的飞行过程中，蜂鸟会选择消耗储存的脂肪来为飞行加油。正如蜂鸟体内的糖代谢非常快一样，在需要的时候，从膳食糖中建立脂肪储备也是非常迅速的。

研究者经PacBio SMRT测序技术对蜂鸟独特的代谢机制进行研究，仅针对蜂鸟特定组织肝脏，进行高覆盖度测序分析，结合最新生信分析方法，通过比较转录组手段，确定了蜂鸟脂肪合成通路中的序列差异和进化情况，解析蜂鸟独特代谢机制。

研究者利用OrthoMCL对红喉蜂鸟119,292个高质量序列和5种鸟类（安氏蜂鸟、烟囱刺尾雨燕、原鸡、斑胸草雀、虎皮鹦鹉）、人以及密西西比鳄进行同源分析。并对与安氏蜂鸟和红喉蜂鸟共有的同源序列进行GO注释。在红喉蜂鸟中确定的与代谢相关的1,444个直系同源序列，有236个（16.3%）是蜂鸟特有的，其中大多数基因都与初级代谢过程相关，在红喉蜂鸟初级代谢中占比最高且特有的是脂代谢过程。

对红喉蜂鸟、安氏蜂鸟、原鸡、烟囱刺尾雨燕、人、密西西比鳄中参与肝脏脂肪合成通路中的8种关键酶的氨基酸进行比较分析，发现蜂鸟通路中关键酶相关序列差异性较高，表明蜂鸟肝脏脂肪合成途径发生了功能适应性进化。研究者在文章中指出，经PacBio测序获得的全长转录本数据，不需要比对，不需要组装，直接获得基因isoforms转录组图谱，如本研究中确定的最长序列是脂肪通路中的acetyl-coA carboxylase 1，分析数据读长超过了7Kb，能覆盖编码区域，同时，Iso-Seq获得的转录组数据结合其他技术，可进一步用于后续代谢等相关研究。

空心莲子草叶甲为什么会专性采食？

02 February 2018, Scientific Reports

空心莲子草是原产于南美的苋科植物，在二十世纪30年代进入中国并迅速成为入侵物种，对当地的生态系统造成了严重破坏。空心莲子草叶甲是空心莲子草的专性天敌，作为生物防治手段而被引入。这种叶甲不仅对空心莲子草有很高的专一性，其环境适应性也较强。

来自山西农业大学的研究者应用PacBio Iso-Seq技术，首次完成对叶甲的四个生长阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）的转录组测序，并基于PacBio SMRT数据，做了进一步的全长转录组标准分析，重构了28,982 条转录本，鉴定了145个可变剪接事件；27,318条简单重复序列；经TransDecoder鉴定获得24,040个ORF，其中有16,205个完整的ORF；预测得到4,198 个lncRNA。同时，研究者还用多个数据库对空心莲子草叶甲基因进行了注释。长读长测序数据保证了转录本鉴定及基因注释的准确性。

这项对于叶甲的全长转录组研究，获得了较完整的叶甲转录本集合，并对转录组进行了较完整的鉴定和注释。尽管这篇文章并未明确定位与叶甲专性采食及其环境适应能力相关的基因，但也为进一步揭开谜底奠定了分子基础，同时也为其他昆虫和生态系统之间的互作研究提供了新的思路。

卡本内苏维浓凭什么在红酒界称王？

22 February 2018，bioRxiv

卡本内苏维浓又名赤霞珠，是最为人熟知、原生于法国的酿酒葡萄品种，在世界范围内广泛分布，其果粒小、果皮厚、出汁量少，含有极高浓度的酚类物质和单宁，使得酿造出的卡本内苏维浓葡萄酒拥有最深邃神秘的酒色和口感。

美国加州戴维斯大学葡萄栽培与环境学系的研究人员基于PacBio Sequel平台的全长cDNA测序提供了葡萄浆果成熟期间的综合性的全长转录本信息，同时结合二代测序数据，完善了Cabernet Sauvignon的基因注释，同时指出Cabernet Sauvignon成熟期的基因表达有异于其他葡萄，这或许正是她独特的魅力的成因。

为了研究Cabernet Sauvignon葡萄有别于其他栽培品种的独特基因，研究者将Cabernet Sauvignon葡萄中的55,886个已注释的转录本与PN40024的CDS区、Corvina葡萄和Tannat葡萄的转录本进行比较分析。研究发现Cabernet Sauvignon葡萄中的独特Isoforms有585个，对应于549个基因，这些基因参与了葡萄生长和浆果成熟的各种细胞过程和代谢过程。

通过GO富集分析发现Cabernet Sauvignon葡萄中有两个生物学过程较为显著——“细胞氨代谢过程”和“氧化还原过程”。在“细胞氨代谢过程”中的两个苯丙氨酸解氨酶基因（PALs；P0148F.500780.A、P0148F.500740.A）在葡萄成熟期间均有表达，且在成熟后其表达上调。在“氧化还原过程”中研究者推测二氢黄酮-3-羟化酶（F3H；P0007F.293800.A）起代表性作用，在葡萄成熟前到成熟、成熟到成熟后的阶段中该酶的表达明显上调。PAL和F3H在类苯基丙烷和类黄酮的生物合成过程中发挥作用，该过程在葡萄浆果中生产多酚类物质。与此类似，其他Cabernet Sauvignon葡萄的一些特异性基因在浆果成熟期间发生差异表达（65个转录本），说明他们参与了葡萄成熟过程。研究者推测是这些基因造就了Cabernet Sauvignon葡萄的独特性质。

尽管这一年三代测序在转录组方面的研究硕果累累，但是篇幅有限，今天组学君就和大家侃到这里吧~

三代全长转录组测序技术为研究者提供了一个可以全面观察物种转录组动态变化的机会——无需拼接，直接获得转录本全长，可获得更多被二代短读长数据遗漏的novel 基因及isoforms，更真实地反映转录组全貌，这将为转录组学研究带来更多新的机遇。武汉未来组配备三代PacBio及Nanopore测序仪，平均下机读长15-20Kb，月均产出高达18-20Tb，拥有丰富的全长转录组研究项目经验。全长转录组研究，未来组是您的不二之选。

2018三代转录组文献汇总

参考文献：1. Workman R E , Myrka A M , Tseng E , et al. Single molecule, full-length transcript sequencing provides insight into the extreme metabolism of ruby-throated hummingbird Archilochus colubris[J]. GigaScience, 2018.2. Jia D, Wang Y, Liu Y, et al. SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 2197.3. Minio A, Massonnet M, Vondras A, et al.Isoform-scale annotation and expression profiling of the Cabernet Sauvignon transcriptome using single-molecule sequencing of full-length cDNA[J]. bioRxiv,2018: 269530.

【2018年末精选】值得一看的三代基因组文章（动物篇）

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动物基因组一直以来都是组学研究领域的热门，目前动物基因组大小数据库（Animal Genome Size Databse）中已经收录了超过6000种有记载的动物，小到如咖啡短体线虫只有0.02pg，约合19.56Mb，而该数据库记录的维多利亚肺鱼基因组达到了近130G，两者相差6600多倍[1]！

 图1 已记录的生物基因组大小范围[1]

随着测序技术的飞速发展，近年来越来越丰富的动物基因组研究极大地推动了人们对于人类起源、物种演化、医学、病虫害防治及濒危动物的保护等方面的认知及研究。2018年，运用三代长读长测序技术完成的动物基因组研究也是成果丰硕，逾40个高质量动物基因组被解析。以下组学君精选几篇高分文章，和您一起探讨动物基因组的奥秘~

  蝾螈基因组[2] 

——低深度三代测序组装完成的超大型基因组，揭示蝾螈断肢再生的秘密

24 January 2018，Nature

1月24日，Nature在线发表美西钝口螈（Ambystoma mexicanum）（~32Gb）基因组组装结果，是迄今组装完成的最大的基因组。研究中利用了三代PacBio测序技术及Bionano光学图谱技术，同时开发了新算法MARVEL，实现了利用低深度三代测序数据（32× PacBio数据）完成对超大型动物基因组的组装。

美西钝口螈基因组中重复序列高达18.6Gb，其中LTR和LINE是最主要的类别，其中不少长度超过10kb，并且组装出的97%的contigs都以LTR元件结尾。通过重复元件的相对形成时间分析得知：美西钝口螈基因组经历了持续时间很长的转座子活跃期，随后发生了近期持续性爆发式的重复序列扩张，大规模的重复序列扩张让美西钝口螈拥有如此庞大的基因组。

HoxA基因在肢体的近远轴（proximal-to-distal）发育中发挥重要作用，并且在断肢再生过程中会被重新活化。本研究中美西钝口螈的HoxA基因位点在单个contig上，含有明显的重复区域，比人类和蛙类的该基因大3.5倍，可能是由于该基因簇中在HoxA3和HoxA4之间存在一段170kb的扩张。

蝾螈的断肢再生功能具有非常重要的临床研究意义，此次美西钝口螈基因组的完成，与以往的单纯转录组数据相比，为研究提供了更为完整的参考信息。

 人类基因组[3] 
——里程碑：首个Nanopore测序完成的人类基因组，即将开启人类基因组完成图时代

29 January 2018, Nature Biotechnology

1月29日，Nature Biotechnology在线发表基于Nanopore超长读长组装人类基因组的研究论文。研究结果显示：低覆盖深度测序（~30×普通nanopore reads+ ~5× ultra-long reads）即能将基因组Contig N50组装到6.4Mb，填补了参考基因组（GRCh38）中12个gap，是单一测序手段得到的迄今最连续的人类的基因组。研究人员通过Nanopore MinION测序平台获得的ultra-long reads，最长读长达到了882kb。基于最先进的测序方法分析人类基因组中先前难以攻克的复杂区域，例如评估人类染色体端粒长度；完整地组装出6号染色体上的MHC区域（位于单个contig上）等，这是MHC首次在二倍体人类基因组中被准确地定向。此次Nanopore测序组装人类基因组研究论文的发表，对新测序技术的推广应用和更连续的人类参考基因组在临床医学研究中的应用意义深远。 

  高等猿基因组[4] 
——三代基因组de novo组装，揭示人类与猿的基因组结构差异

08 June 2018, Science

尽管近年来人们在类人猿和人类基因组的测序组装中做了很多努力，但我们对结构差异的理解，特别是对人类谱系特异性的理解，还远远不够。在以往的研究中存在两个基本问题：一是在类人猿基因组中存在相当大的杂合性；二是高质量的人类基因组常常被用来指导非人类基因组的组装，包括序列的顺序和方向，甚至是基因的注释。这造成了其他非人类基因组的“人类化”，结果导致很难发现在这些物种之间的结构变异和转录本差异。

为了解决这个问题，美国华盛顿大学Eichler研究组使用PacBio SMRT长读长测序技术及光学图谱技术，同时结合全长转录组测序辅助基因注释，生成了新的人类和类人猿基因组并着重分析了这些基因组中的结构变异事件。研究结果表明，与人的进化距离越远，结构变异的数目越多。

该研究还进一步研究了人与黑猩猩脑器官差异表达相关基因，研究表明，与黑猩猩相比，人特异性结构变异基因中与放射状胶质神经组细胞相关的基因表达下调。

这项研究充分体现了长读长测序在基因组de novo组装及完善基因组注释中的作用，不依赖于参考基因组的测序组装最大程度地保留了物种的特异性基因组信息，为研究近缘物种的演化及结构变异提供了有效方法。

 考拉基因组[5] 

——揭示考拉独特的“解毒”机制

02 July 2018, nature genetics

考拉又称树袋熊，主要栖息地是澳大利亚东部的桉树林区。近年来，由于栖息地减少、疾病传播等原因，考拉面临着极大的生存挑战，澳大利亚采取了一系列措施保护这一珍稀物种。

澳大利亚博物馆研究所等机构的研究人员和英国、美国等国同行在Nature genetics杂志上发表关于考拉全基因组的研究论文，该研究运用三代PacBio测序技术和二代Illumina测序技术，获得了高质量的考拉基因组，发现了超过2.6万个基因，进一步分析揭示出与考拉饮食习惯、免疫系统等有关的基因调控机制。

研究人员发现考拉对桉树叶片的解毒能力可能是与细胞色素P 450基因家族的扩张有关，这种被称为“细胞色素Ｐ450”的酶在生物代谢过程中扮演重要角色。关于犁鼻器和味觉感受器的基因家族扩张也使得考拉能够在众多桉树中找到次级代谢产物较少的叶子以供食用。考拉容易受到衣原体感染，为了保护刚出生的幼崽，考拉的乳汁中含有一种特殊蛋白质，能对抗包括衣原体在内的一系列细菌和真菌。

这一研究成果极大的促进了考拉生理、遗传学研究的系统性和科学性，同时对遏制考拉野生种群数量持续走低也有着积极意义。

  牛基因组[6]

—— Trio Binning方法突破单倍型基因组组装难题

22 Oct 2018, Nature Biotechnology


美国国家人类基因组研究所、Pacific Biosciences公司及阿德莱德大学等单位的研究人员开发了一种新技术，通过简单的方法即可实现从二倍体中组装出完整的单倍体基因组，这项新技术是基因组组装领域的重大突破，使研究人员能够鉴别从植物到动物等任何类型基因组中的复杂性，并获得比目前更为精确的参考基因组。该研究成果发表在10月22日的Nature Biotechnology杂志上，一经发布便引起广泛关注。

复杂的等位基因变异阻碍了二倍体基因组中单倍型序列的组装，为此研究者开发了trio binning方法，通过在组装前解析等位基因变异来简化单倍型的组装。与以往的方法恰恰相反，该方法的有效性随着杂合度的增加而提高。Trio binning首先使用来自两个亲本基因组的高精度短读长数据将子代的长读长序列划分为单倍型特异性的集合，然后每个单倍型独立组装，形成一个完整的二倍体重建。这一新方法运用了读长更长的PacBio测序技术，首次给出了每条染色体的真正基因组序列，获得迄今为止最高质量的两个牛亚种基因组。将该方法应用到拟南芥和人类家系中，同样获得了理想的分型效果。

该论文的作者之一John L Williams教授说，trio binning技术已经彻底改变了他们以前的技术，他说：“到目前为止，基因组序列都是由遗传差异最小的个体构建的。Trio binning技术标志着技术能力的重大进步，对研究和医学应用具有广泛的意义。” 并指出Trio binning技术将有助于建立更准确的个人基因组变异信息，这将提高基因测试的准确性，并有助于获得个人独特DNA序列，从而在其临床治疗上提供帮助。

 伊蚊基因组[7] 

——高质量伊蚊基因组，带来蚊虫防治新思路

14 November 2018, Nature

埃及伊蚊是传播包括登革热、黄热病、寨卡病毒以及切昆贡亚热在内的可怕疾病的载体。由于缺乏高质量的参考基因组，在了解蚊子生物学特性及蚊子防治等方面依然困难重重。

由洛克菲勒大学领导的国际研究团队结合PacBio测序、Bionano光学图谱、Hi-C分析、10x Genomics linked-read测序以及Illumina的短读长测序多种手段大大升级了埃及伊蚊的参考基因组并进行了重新注释，通过锚定物理图谱和细胞遗传图谱，研究者在伊蚊基因组中鉴定出了两倍于已知的、引导蚊子以人类为目标、定点产卵的化学感应离子受体。

研究还发现了有助于深入了解雄性性别决定位点的大小和组成并揭示杀虫剂耐药性关联基因之间的拷贝数变异。使用高分辨率的定量性状位点和群体遗传分析，研究者定位到了新的与登革热传染能力和拟除虫菊酯抗性相关的候选基因。

长读长测序技术及光学图谱、染色体构象捕获等技术的应用为人们展示了更精细的物种基因组结构，使人们得以更进一步地探索生命的奥秘，了解物种独特的特性及功能背后的基因密码。武汉未来组专注三代测序技术的研发与应用多年，依托于自身的PacBio、Nanopore、Bionano光学图谱及MGISEQ等平台，已合作发表多篇三代测序基因组文章。选择未来组，我们将为您提供高质量、高效率的三代基因组测序分析服务。

2018已发表三代动物基因组（PacBio）

2018已发表三代动物基因组（Nanopore）

参考文献：

[1] http://www.genomesize.com/statistics.php?stats=entire#stats_top

[2] Sergej Nowoshilow, Siegfried Schloissnig, Ji-Feng Fei , et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.Nature.2018

[3] Jain M, Koren S, Quick J, et al. Nanopore sequencing andassembly of a human genome with ultra-long reads[J]. bioRxiv, 2017: 128835.

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