关于杜仲(Eucommia ulmoides)

杜仲是我国特有的、除三叶橡胶外世界上具有巨大开发前景的优质天然橡胶树种和名贵药用树种，国家二级保护野生植物。杜仲能耐严寒，成株在-30℃的条件下可正常生存，张家界、神龙架都有分布。获得高质量的参考基因组，解析杜仲环境适应及杜仲胶生物合成机制，对研究杜仲的起源和进化，遗传改良具有里程碑意义。

2017年11月，中国林业科学研究院经济林研究开发中心乌云塔娜团队、杜红岩团队，联合中国热带农业科学院橡胶研究所李德军团队及山东贝隆杜仲生物工程有限公司高瑞文团队合作完成耐寒橡胶树-杜仲基因测序和转录组研究，相关成果在线发布于《Molecular Plant》。

未来组在本项目中负责完成基因组测序、Bionano辅助拼接，基因组组装、基因注释和转录组测序分析等部分的工作。

材料与方法

基因组

神农架野生杜仲叶

二三代混合测序并BioNano辅助组装，转录组辅助基因组注释

转录组

同一棵杜仲不同生长发育时期的叶和果实进行RNA-Seq

结论

基因组组装和注释

预估基因组大小1.1Gb，组装基因组大小1.18Gb，重复序列~61%，杂合度0.8%，

Scaffold N50：1.88 Mb，注释了26,723个蛋白编码基因。

通过转录组数据、ESTs数据比对，以及CEGMA和BUSCO分析评估组装基因组的完整度和准确度，结果表明基因组组装效果good。

基因组起源和进化分析

通过分析单拷贝基因，构建杜仲与14种植物的系统发生关系（Fig.1），研究表明杜仲与真菊I类和II类的分化时间可追溯到约在一亿两千九百万年前。

Fig.1杜仲遗传起源

通过同义替代突变分析（Fig.2左），以及与3个已知物种（葡萄发生过1次基因组倍增，番茄发生过2次倍增，猕猴桃发生过3次倍增）进行共线性关系比较（Fig.2右）得知，杜仲仅经历了一次古老的基因组三倍化事件，无近期基因组复制发生。

Fig.2杜仲基因组倍增事件分析

影响环境适应性的基因

杜仲是从历经了白垩纪存活下来的活化石，有着极高的抗逆性，文章对杜仲的环境适应性相关基因进行了分析，筛选了与环境耐受性和次生代谢相关的扩张基因。

杜仲的生物胶合成

通过RNA-seq分析同一棵杜仲不同生长发育时期的叶和果实中杜仲胶合成相关基因的表达水平，并结合这些样本中生物胶的含量检测，得出结论：杜仲中生物胶的前体物质异戊二烯焦磷酸（IPP）可能主要来自甲瓦龙酸途径（MVA途径）（Fig.3）。

Fig.3与杜仲胶相关的基因、代谢通路和表达谱分析

杜仲胶由反式聚异戊二烯(TPI)形成，橡胶树橡胶由顺式聚异戊二烯(CPI)形成。小橡胶颗粒蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)被推测与生物胶合成相关，在杜仲和橡胶树中，REF/SRPP基因家族都存在显著扩张，而与橡胶树SRPP和REF基因同时参与CPI合成不同，在杜仲中只有SRPP基因参与TPI合成，REF基因皆为低表达甚至无表达（Fig.3）。

法尼基焦磷酸合酶(FPS)是生物胶合成途径中的一种关键酶，杜仲FPS基因家族存在扩张并出现功能分化，产生了具有反式长链橡胶合成功能的II类FPS基因(Fig.4 a)。进化分析显示，杜仲和橡胶树的REF/SRPP基因家族成员属不同分支(Fig.4 b)。

Fig.4 FPS/REF/SRPP基因家族系统发育分析

研究人员综合分析结果，绘制了橡胶树橡胶(顺式聚异戊二烯，CPI)和杜仲胶(反式聚异戊二烯，TPI)合成途径及关键酶(Fig.5)，推测双子叶植物中橡胶生物合成为多起源。

Fig.5杜仲和橡胶树的产胶生物途径比较

中国林业科学研究院经济林研究开发中心等研究团队首次获得了杜仲高质量基因组序列并解析了杜仲环境适应及胶生物合成机制，对杜仲生物学研究、良种培育、种植及产业链形成具有重要意义。

PacBio长读长测序和BioNano光学图谱技术的引入，对杜仲基因组的组装连续性有了很大的帮助。未来组拥有Sequel、Nanopore、BioNano及Hi-C等平台，同时搭载天河二号和阿里云服务器，在承诺高标准交付指标的同时，将进一步大幅压缩项目服务周期，为合作伙伴提供专业优质的服务。

参考文献

Wuyun T,Wang L,Liu H,et al.The hardy rubber tree genome provides insights into the evolution of polyisoprene biosynthesis[J].Molecular Plant,2017.

萤火虫可以通过发光细胞中的荧光素和ATP，在荧光素酶的催化作用下，与氧发生化学反应，形成氧化荧光素并且发出荧光。萤火虫发出的荧光是一种冷光，其发光效率可高达98%左右。

萤火虫可以利用荧光的闪烁节奏形成特定的闪光信号，主要用来吸引异性交尾，偶尔也起一定的警戒作用。这种行为与蟋蟀鸣叫，蝴蝶起舞等类似，都可归为求偶行为，因为场面过于浪漫，被人们赋予更多诗意。

夏夜、繁星，微风吹拂，蒲扇轻摇，流萤如一盏盏悬空点燃的小灯笼，舞动出独属夜的宁静和美妙。然而，这些可爱的小精灵如今却难觅踪迹。萤火虫家族急速缩减，有几个主要原因：一是过度砍伐森林或过度景观开发导致萤火虫栖息地被直接破坏；二是光污染；三是农药的使用；四是水污染。

2016年4月，未来组联合中国最权威的萤火虫自然保护研究中心——守望萤火，共同启动对萤火虫的基因组测序研究。依托守望萤火研究中心多年的物种保护和研究经验，对萤火虫基因组进行深度测序，将有助于我们理解这种萤火虫独特的闪光求偶行为，保护萤火虫生物多样性，进而守望萤火，守护美丽和惊奇。

胸窗萤（Pyrocoelia pectoralis）

胸窗萤基因组大小预估为785Mb，杂合度在2%-3%，有约>40%属于重复序列，这些特性都是构建参考基因组过程中需要面临的困难。

Fig.1 基因组survey k-mer分析图

未来组通过高深度的PacBio测序，加上二代数据校正，以及去除组装基因组冗余，最终构建高质量的参考基因组（760.4Mb），覆盖预估基因组大小的96.9%，contig N50=3.04Mb，是迄今为止除了模式动物果蝇之外，基因组组装连续性最高的昆虫基因组，经过BUSCO评估基因完整性很好（Table 1）。

通过转录组reads和注释的unigenes评估基因组注释情况，有98%的unigenes可以比对到基因组上（Table 2）

未来组为构建高杂合高重复序列的复杂昆虫基因组，搭建个性化work flow（见后图），据此获得的高质量的萤火虫基因组，为进一步研究荧光的产生，特殊的求偶行为提供基础。

work flow

Nanopore自2013年初次开放试用以来,一直犹抱琵琶半遮面，到了今年9月才得以进入中国市场。

在中间这约4年的时间里，官方宣传的侧重点主要是便携式MinION测序仪的建库时间短，测序仪体积小，样本起始量小等，能够进入到比较极端的环境进行菌种鉴定和环境微生物多样性研究等，例如深入到埃博拉病毒和寨卡病毒蔓延的疫区，南下至南极泰勒谷，也曾搭乘SpaceX 9太空飞船进入国际空间站。

随着测序仪机型的升级和试剂版本的更新，单flowcell的通量不断上升，读长分布也不断提升，Nanopore继而将服务目标瞄准了更具挑战性的动植物基因组，期望借助超长读长的优势，解决大型动植物基因组的组装难题。

目前唯二发表的纯Nanopore组装的GB级别基因组，除了之前未来组解读过的野生番茄（正式发表于The Plant Cell^[1]），就是今年4月预印的人类基因组了^[2]，以下为大家介绍其组装情况。

利用Nanopore技术测序和组装人类基因组

测序数据量：在Oxford Nanopore MinION平台上测序39 flowcells产出91.2 Gb （~30×），试剂版本R9.4，再加入~5×ultra-long reads，最长读长882 kb。

测序数据评估

通过与参考基因组GRCh38比较，每个位点的覆盖度与预期相符合，呈泊松分布(λ=27.4) (Fig.1 A)，并且reads的长度并不影响比对一致性 (Fig.1B)。

Fig.1 reads与参考基因组比对

组装效果评估

未经polishing的组装结果与参考基因组比对，一致性达95.74%。经过2遍Pilon校正后，一致性达99.88%(Fig.2)。或者单独经过Nanopolish也能达到99%以上，如果Nanopolish联合2遍Pilon校正，更能达到99.9%以上（Table 1）。

最终~30×的普通reads+~5×ultra-long reads，组装contig N50达6.4 Mb。6号染色体上的MHC区域被完整地组装出（包含在一个15Mb的contig内）。

Fig.3 染色体级别的组装

黑色和灰色区域表示能mapping到参考基因组
白色区域表示unmapped 序列,可能由参考基因组中的N碱基造成

本论文成型于Nanopore MinION开始试用的初期，5家单位联合产出了这些测序数据，下机reads的准确度约在80%-90%之间，在约35×的数据量情况下，contig N50>6M，初始组装准确度95.74%，经Nanopolish（and/or）2次Pilon校正后可达99 %以上。

整个项目测序37个flowcell，项目预算低于$30,000，组装指标优越，当属性价比超高。应用Nanopore组装复杂动植物基因组，将成为近几年的主流策略。

参考文献

Jain M, Koren S, Quick J, et al. Nanopore sequencing andassembly of a human genome with ultra-long reads[J]. bioRxiv, 2017: 128835.

随着Nanopore平台不断升级，通量和准确率得到极大提升，不断有研究者开始通过Nanopore数据进行更大基因组组装，以及应用direct RNA测序直接读取RNA碱基修饰信息，未来Nanopore技术应用潜力无限，Oxford Nanopore技术将成为测序技术的主流，引领行业发展。

武汉未来组（NextOmics）作为国内三代测序技术应用的开拓者，自2011年起一直致力于将领先的技术提供给关注前沿科学的合作伙伴。我们是中国首家PacBio测序服务供应商，是亚太区首批PacBio Sequel测序中心，2017年9月未来组率先引进6台Oxford NanoporeGridION X5，成为Oxford Nanopore测序中心。

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参考文献

[1] Tyson J R, O’Neil N J, Jain M, et al. Whole genome sequencing and assembly of a Caenorhabditis elegans genome with complex genomic rearrangements using the MinION sequencing device[J]. bioRxiv, 2017: 099143.

[2] Michael T P, Jupe F, Bemm F, et al. High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell[J]. bioRxiv, 2017: 149997.

[3] Jain M, Koren S, Quick J, et al. Nanopore sequencing andassembly of a human genome with ultra-long reads[J]. bioRxiv, 2017: 128835.

[4] Schmidt M H W, Vogel A, Denton A K, et al. De novo Assembly of a New Solanum pennellii Accession Using Nanopore Sequencing[J]. The Plant Cell, 2017, 29(10): 2336-2348.

[5] Jansen H J, Liem M, Jong-Raadsen S A, et al. Rapid de novo assembly of the European eel genome from nanopore sequencing reads[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 7213.

近日，研究者经Oxford Nanopore长读长测序技术完成了对预估基因组大小约为1G的野生番茄（Solanum pennellii）测序组装工作，文章发表于 The Plant Cell。经Nanopore测序技术组装的野生番茄LYC1722基因组，组装指标Contig N50高达2.5Mb，其基因组连续性、基因完整度及其他技术指标高于Illumina组装的番茄LA716基因组结果。结果表明Nanopore长读长测序技术以轻量级的预算已可完成Gb级别基因组的测序组装工作。

利用Nanopore测序技术的番茄基因组文章刚正式发表了，ONT 在Gb级别的动植物基因组组装情况如何？请看下文。

研 究 方 法

1. 研究材料：选择自交亲和的Solanum pennelliiLYC1722品种
2. Nanopore测序：共上机31个flowcells。

（1）长片段（12-80 kb，15-80 kb）筛选建库，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108)，20 μg DNA/library，29 个ONT MinION flowcell (R9.4)

（2）未经片段筛选建库，24 μg DNA/2 library，2 个ONT MinION flowcell (R9.4)

研 究 结 果

数据下机情况

31个flowcell总产出为134.8G，flowcell产量在1.1-7.3G范围，大部分数据都是测序运行的24h内产生的（Figure 1），其中“Passed filter”为110.96G（基本上是预估基因组1-1.1G的100X测序量），过滤后的平均Q-score为7.44，在文库优化后的产出读长，过滤的平均读长在6,625-15,869bp间，最长read可达153,099bp。

Figure1 番茄Solanumpennelli 31个MinION flowcell测序产量情况

何种基因组组装策略最优？

为评估哪种组装策略对Nanopore在植物基因组组装效果更好，研究者经Canu、SMRTdenovo、miniasm及Canu-SMARTdenovo（经Canu校正过程和SMRTdenovo组装）几种组装策略对番茄基因组进行组装，发现Canu-SMARTdenovo组装效果最优：Contig N50 达2.45 Mb，Contig总数量为899，最大的Contig为12.32Mb，另外，每种组装策略对运算条件要求都各异（Table 1）。

Table1 番茄基因组Nanopore不同组装策略结果及纠错后组装结果

研究者提取了番茄基因组Nanopore数据量的40%，60%，80%数据，经miniasm，Canu，SMARTdenovo及Canu-SMARTdenovo进行组装测试，并经二代数据polish，发现Canu-SMARTdenovo组装效果始终最优（Figure 2）。另外，经片段筛分后构建的文库每个flowcell产出20Kb以上的读长占15%，而未筛分片段的文库产出20Kb以上的读长占3%，说明protocol的优化利于后续读长产出。

Figure2 番茄Solanum pennellii不同组装策略结果对比

番茄基因组组装质量如何？

经Nanopore原始数据组装的结果表现出明显的高错误率和高误差率，而经Nanopore-based polisher Racon或Nanopolish对错误率和基因覆盖改善效果不佳，而经Illumina数据对组装结果进一步Pilon polish，发现经Pilon迭代polish能有效降低组装结果的错误率和误差率，基因覆盖完整性提高到85%-96%（Table1， Pilon polished 5X）。同时结合其他番茄品种基因组及拟南芥基因组进行基因间比较发现，相对番茄Solanum pennellii LA716，番茄Solanum pennellii LYC1772基因组组装的完整性更完善。

此次番茄基因组Nanopore测序工作得到了高质量的番茄基因组，研究者最后粗略估算了下成本，对于这种中等大小的植物基因组（<2Gb）的Nanopore测序，在当时当地情况下，项目预算低于$25000，其他开销主要是计算资源，人力成本和耗损等。另一方面，Nanopore测序下机数据含有CpG甲基化数据信息，在不需要增加成本的情况下，可利用甲基化信息对物种进行深层次的表观关联研究。

参考文献

Schmidt M H W, Vogel A, Denton A K, et al. De novo Assembly of a New Solanum pennellii Accession Using Nanopore Sequencing[J]. The Plant Cell, 2017: tpc. 00521.2017.