HLA分型 & MinION （三代测序那些事儿 第十一期）

MinION Acess Program（MAP）2014-

这期接着聊MinION，还不知道MinION为何物的小伙伴可以阅读小编的上一期文章或者访问Oxford Nanopore官网：www.nanoporetech.com。

Oxford Nanopore 2014年面向全球推出了其三代测序系统MinION的试用计划（MinIon Access Program），申请者只需支付1000美元便可得到MinION及其配套的建库试剂盒、在线分析软件等，Nanopore可根据反馈数据进一步完善其MinION系统。

这种全球性的知识众筹行为让Nanopore在短短一年里获得了大量的专业经验， 目前MAP计划已经产生了20多篇研究成果，涵盖了数据处理^[1]、致病菌/病毒鉴定^[2-3]、基因组组装^[4-6]、Isoform 测序^[7]、HLA分型^[8]等众多组学研究热点，这对Nanopore来说算得上钵盆满盈。

PS:目前试用计划只支持DNA片段测序文库。

上期三代那些事儿里小编为大家分享的是MAP计划中分别来自法国（Institut de Génomique）、英国（伯明翰大学）、美国（冷泉港）的研究团队的几个微生物基因组MinION数据组装成果，展示出该超长读取的新型测序技术已经初步具备了快速绘制微生物基因组完成图的能力。

MinION在HLA分型中的首次尝试^[8]

这期分享的是来自加拿大多伦多大学的一篇研究（MAP计划成果），研究中Ron等人尝试使用MinION数据实现对HLA-A、HLA-B的高分辨率分型，即等位基因（Alle）级别的四位数分辨率（4-digit resolution）。

HLA中文名为白细胞表面抗原，对抗原呈递和免疫信号传递起关键作用，是人体中最复杂的遗传多态系统，同时等位基因具有共显性表达的特点，截止2015年4月，IMGT/HLA数据库中收录了36个HLA基因座位，Alle数目高达13,023个。

HLA的高分辨率（等位基因级别）分型对于器官移植、精确用药（比如用于治疗HIV/AIDS的嘌呤醇、阿巴卡韦等）至关重要。

基于NGS的PCR-SBT法是目前主流的HLA分型方法，但由于其读长较短往往难以得到Alle级别的高分辨率分型结果，借助双亲数据以及HapMAP单体型（注意区分单倍体型）数据Phasing得到的高分辨率结果通常存在较大的误差。

研究中使用MinION装置对个体NA12878（CEPH/Utah Pedigree 1463）的HLA-A、HLA-B扩增子进行了测序，使用了R7.3新型试剂，经所测数据比对回人类参考基因组GRch37上，每个基因座位得到了~1000 X MinION 2D Reads，准确率在70-90%，长度大多为4-5kb（见图1），代表了大多数reads包含了完整的HLA基因（HLA-A、HLA-B基因5kb左右）。

                   图1 Reads（Blasr mapping to GRch37）长度分布

使用HLA GATK HLA Caller 预测了基于上述MinION数据的HLA-A、HLA-B基因型，得到高分辨率的等位基因型预测结果：

HLA-A Alle 1 *01:32 、HLA-A Alle 2*03:12；
HLA-B1 Alle 1*07:56、HLA-B Alle 2* 55:10。

然而，使用NGS、飞行质谱等数据，借助HapMAP 单体型数据校正，却得到了与上述相差较大的等位基因分型结果：

HLA-A Alle 1 *01:01 、HLA-A Alle 2*11:01；
HLA-B1 Alle 1*08:01、HLA-B Alle 2* 56:01。

从四位数分辨率的分型结果来看，较高原始错误率的MinION数据似乎并不能马上胜任HLA的临床分型。

但小编相信随着原始错误率的降低以及分型算法的改进，MinION会成为一款应用于HLA临床分型的便携式装置。

另一种也是目前唯一商业化的三代测序技术的PacBio SMRT已经在HLA分型中做了较为成功的尝试，英国安东尼诺兰研究所使用该技术对7个个体中的HLA-A、HLA-B、HLA-C基因进行了分型，共得到38个等位基因型，大多数达到了六位数级别的超高分辨率，其中30个与IMGT/HLA数据库中收录的基因型完全相符，见表格2^[9]。

Paper：
[1] Poretools: a toolkit for analyzing nanopore sequence data .
[2] MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.
[3] Bacterial and viral identification and differentiation by amplicon sequencing on the MinIONT nanopore sequencer
[4] A complete bacterial genome assembled de novo using only nanopore sequencing data.
[5] Genome assembly using Nanopore-guided long and error-free DNA reads.
[6] Oxford Nanopore Sequencing and de novo Assembly of a Eukaryotic Genome
[7] Determining Exon Connectivity in Complex mRNAs by Nanopore Sequencing
[8] Long read nanopore sequencing for detection of HLA and CYP2D6 variants and haplotypes
[9] HLA Typing for the next Generation.