项目文章|河南农大绽放科技之花，首个gap-free桃基因组惊艳问世！

2024年9月，河南农业大学园艺学院冯建灿和谭彬教授领衔的桃生物学与种质创新团队在国际知名期刊《PlantBiotechnologyJournal》发表题为“A gap-free genome of pillar peach (PrunuspersicaL.) provides new insights into branch angle and double flower traits”的研究论文。该研究通过ONT ultra-long、Hi-C和RNA-seq等测序技术完成首个gap-free桃基因组，这为柱型桃分枝角度和重瓣花的进一步深入探索研究奠定了坚实的理论根基。希望组承担了该研究的ONT ultra-long、Hi-C和RNA-seq建库测序和组装注释工作。

桃（Prunus persica L.）是蔷薇科李属落叶小乔木植物，在世界各地广泛种植。然而，现有桃的参考基因组含有一定的缺口，也缺少特殊树型等性状的参考基因组，这使桃的基因注释及基因定位和桃树型等农艺性状改良受到限制。基于此，作者选择‘照手红’桃（ZSH，分枝角度小，花重瓣）作为研究对象，利用ONT ultra-long（203.7×）的reads长度优势和Hi-C（119.5×）数据的空间定位定向优势开展基因组组装，获得8条染色体，其中1、2、3、4、6、7这6条染色体由1条contig组成，5号染色体有2个gap，8号染色体有1个gap。在ONT ultra-long数据的填补下，所有染色体实现0 gap。在此基础上，进一步开展端粒和着丝粒鉴定，得到全部的16个端粒和8个候选着丝粒，最终成功获得1个gap-free桃基因组，大小为239.34Mb，contig N50为29.67 Mb，BUSCO评估98.88%，LTR组装指数为31.03，完整性99.63%，准确性QV=53.3，预测到24901个蛋白编码基因，其中23253个基因被功能注释（图1），这些数据表明ZSH基因组达到高质量基因组的应用标准。

图1：ZSH基因组特征展示

1.  分枝角度性状的结构变异分析及候选基因的鉴定

分枝角度是果树最重要的农艺性状之一。为了鉴定影响ZSH桃分枝角度的主要基因，作者通过ZSH与7个普通型桃（分枝角度大）基因组进行结构差异分析并检测到3523个基因的9100个变异（图2）。为了进一步确定可能参与分枝角度发育的候选基因，作者对两个普通型桃（HSM和Okubo）和两个柱型桃（ZSH和SHLZ）进行转录组分析，发现25个基因在普通型桃中的表达量高于柱型桃。其中鉴定到与分枝角度紧密相关的基因PpTAC1，与普通型桃相比，ZSH中的PpTAC1基因在启动子上缺失了11bp，外显子上插入了4422bp，导致基因移码突变，丧失功能。作者进一步通过其它10个柱型桃品种与普通型桃进行比较，发现柱型桃品种的PpTAC1编码或启动子序列中均存在变异，这些结果表明，PpTAC1基因的变异与桃分枝角度密切相关（图2）。

图2：柱型桃分枝角度小相关基因PpTAC1的鉴定

2. miR172d和PpAP2共同调控桃单/重瓣花性状形成

作者对334份自然群体进行单/重瓣花性状的GWAS分析，发现在Chr2上有显著峰，在Chr6上有次要峰（图3）。通过比较基因组和PCR验证分析，在重瓣花品种中Chr2定位位点发现miR172d基因存在5033bp和1210bp插入，随后将插入片段设计分子标记，进而在32个重瓣花和6个单瓣花中进行分子标记验证，发现在27个重瓣花品种中检测到1210bp或5033bp的插入，而在6个单瓣花品种和其他5个重瓣品种中不存在插入（‘No.18’、‘HongChuizhi’、‘Huayulu’、‘1-1-4’和‘1-2-7’）。

为了进一步鉴定与单/重瓣花性状有关的其它候选基因，作者选取‘No.18’（重瓣花）和‘Okubo’（单瓣花）以及F1群体用于鉴定候选基因。利用BSA分析确定Chr6上的一个重要位点（图3）。通过对亲本‘No.18’和‘Okubo’进行重测序分析进一步确定Pp06G22680.t1的编码区域有一个994bp的杂合缺失，而Pp06G22680.t1能够编码在花发育中起作用的转录因子（PpAP2）。通过实验验证发现994bp的缺失在所有重瓣花子代中存在，而在单瓣花的杂交子代中不存在。这一结果表明PpAP2中994bp的缺失对‘No.18’桃重瓣花性状紧密相关。对miR172d没有变异的4个重瓣花品种中验证，发现‘HongChuizhi’、‘1-1-4’和‘1-2-7’中PpAP2存在缺失变异，但‘Huayulu’没有994bp变异。

作者又对‘Huayulu’分析，发现PpAP2存在一个SNP突变（G/T）。通过烟草瞬时表达实验发现miR172d可靶向并降解PpAP2（Gtype），但因为miR172d的结合位点从G到T的突变使其无法靶向和降解PpAP2，从而导致‘Huayulu’桃的重瓣花性状。通过以上结果发现miR172d和PpAP2共同调控桃单/重瓣花性状的形成。

图3：调控桃单/重瓣花性状的基因鉴定

该研究通过完成首个gap-free桃参考基因组并对基因结构进行人工校正，以确保较高的准确性。结合比较基因组、转录组、GWAS和BSA等分析鉴定到PpTAC1、miR172d和PpAP2的变异分别参与到分枝角度、单/重瓣花性状表型调控。gap-free桃参考基因组的成功搭建为桃树及其近缘种的遗传改良提供了宝贵的基因组资源。