未来组项目文章||三代测序助力发现替加环素耐药基因

细菌耐药性一直是微生物研究的重点领域，肠杆菌科细菌耐药性的出现和蔓延对人类和动物的健康构成了严重威胁。碳青霉烯类药物、黏菌素和替加环素被认为对多重耐药的革兰氏阴性细菌有效，然而随着碳青霉烯类药物和黏菌素耐药性的爆发，替加环素成为治疗多重耐药细菌感染的最后一道防线。

替加环素的耐药性不可避免的出现，四环素破坏酶Tet(X)具有一种独特的酶促四环素失活机制，研究已证实Tet(X)在体外对包括替加环素在内的所有四环素有降解活性，然而其分布、遗传结构和临床意义仍有待探索。在本研究中，作者描述了一个质粒介导的可移动替加环素耐药基因tet(X4)，并探讨了tet(X4)阳性大肠杆菌在中国人群、食用家禽家畜及其周边环境中的流行情况(图1)。

研究者2017年从猪粪中分离到一株具有替加环素耐药性的大肠杆菌菌株LHM10-1，全基因组测序结果表明LHM10-1的序列类型属于ST515，包含一条4.81Mb的染色体和6个质粒。其中在pLHM10-1-p6质粒上发现了一个全长1158 bp 编码385个氨基酸（图2a）的tet(X)-like基因，命名为tet(X4)。基因克隆实验、平板扩散分析以及四环素降解实验均证明Tet(X4)蛋白能够对整个四环素家族产生耐受性（图2b,c,d）。体内实验表明tet(X4)阴性菌株感染小鼠对替加环素处理高度敏感，而替加环素对tet(X4)阳性菌株感染的小鼠治疗24小时后无明显影响（图2e），由此推测，tet(X4)基因的存在可能是导致替加环素治疗失败的原因之一。

图2 Tet(X4)在体内外对四环素的作用

2、pLHM10-1-p6质粒特征分析

对包含tet(X4)序列的质粒pLHM10-1-p6分析表明，该质粒属于宽宿主范围的IncQ1类质粒，与其他IncQ1质粒比较，它们共享类似的序列区域（图3）。进一步实验发现，可以将替加环素耐药性从大肠杆菌LHM10-1转移到多种实验室菌株中；连续220世代无抗生素培养后，pLHM10-1-p6质粒仍然在不同菌株中稳定存在，表明tet(X4)具有很高的可转移性和稳定性。这也使得质粒pLHM10-1-p6在临床耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE）菌株上也表现出良好的转入能力，这些结果暗示：质粒介导的可移动的替加环素耐药基因tet(X4)有可能产生真正的泛耐药菌株，从而导致感染无药可治。

图3 携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6质粒特征

3、tet(X4)阳性菌株的流行情况

本研究从4,189个不同地区和来源的样本中共检测到42个菌株携带tet(X4)基因，这些阳性大肠杆菌分离株在中国东部和南部5个省均有发现(图1)。药敏试验表明，42个tet(X4)阳性菌株全部具有对替加环素、四环素、磺胺甲恶唑-三甲氧苄啶和氟苯尼考的耐药性。质粒分析发现57.1%（24/42）的tet(X4)阳性菌株含有相同的IncQ1类型的pLHM10-1-p6-like质粒。在自传播辅助质粒存在下，IncQ1类型质粒能够转移到广泛的细菌宿主中。携带tet(X4)基因的pLHM10-1-p6-like质粒在转移的过程中，常见的携带mcr-1（一种粘菌素抗性基因）的质粒可以作为其辅助质粒，这进一步促进了替加环素耐药性的传播。

以上研究表明tet(X4)基因导致的替加环素耐药性菌株可能已经在中国传播，作者推测这种新型可移动替加环素耐药性菌株的出现，很有可能是一代或二代四环素的使用导致的。在中国，替加环素只被批准用于治疗人类的临床感染，第一代和第二代四环素被广泛用于治疗食用家禽家畜的感染治疗或者促生长使用，这很可能为替加环素耐药菌的出现提供了选择压力。来自环境、兽医使用以及临床实践的持续选择压力将可能加速tet(X4)等抗性基因的传播。因此，作者强调采用“one-health”策略，即通过对人类、动物及其生活环境进行跨部门监测和控制来应对抗生素耐药性，同时呼吁人们在动物和环境中合理使用四环素。