Nanopore直接RNA测序

短读长、长读长与ONT直接RNA测序分析的比较

产品优势

直接RNA测序无需PCR，没有测序GC偏好性

由于PCR 过程具有GC偏好性，对GC含量过高或过低的序列不容易扩增，所以短读长测序在建库和测序过程中都会引入GC偏好，降低了定量分析的准确性。使用ONT测序技术（直接 cDNA & 直接 RNA），无需PCR扩增，提供无偏倚、全长、链特异性的RNA序列。

纳米孔数据集里的GC偏倚低于短读长数据集

准确检测转录本 poly（A）尾长度

转录本 poly(A) 尾被认为在转录后调控中起到重要作用，包括mRNA的稳定性和翻译效率。poly(A)尾长度可达数百个核苷酸，使用短读长测序的数据很难进行测量。ONT直接RNA测序获得的全长转录本包含poly(A)尾信息，利用算法工具计算出poly(A)尾的长度，估算每个读长序列的poly(A)尾长，甚至能够发现异构体间poly(A)尾的区别。

Nanopore 直接 RNA 测序鉴定转录本 poly（A）尾长

直接 RNA 测序鉴定 RNA 碱基修饰信息

短读长测序由于在建库过程需要 PCR，从而丢失了 RNA 分子中的碱基修饰信息。直接 RNA 测序不需要扩增或链合成，这意味着在测序过程中，修饰碱基直接穿过纳米孔，在原始信号中产生与未发生修饰的碱基不同的电流特征。通过特定的软件算法对电流特征进行识别，即可鉴定碱基修饰信息。

Nanoproe 直接 RNA 测序检测天然 RNA 修饰

方案策略

分析内容

• 原始数据质控
• RNA碱基修饰检测
• Poly（A）尾长估算
• 参考转录组比对
• 基因功能及转录本结构注释
• 差异基因/转录异构体定量
• 功能富集、蛋白互作分析

结果展示

转录本聚类去冗余

由于同一条转录本在细胞中的一个时间点下可能存在多个拷贝，并且不同的转录本拷贝在测序过程中5’端又可能存在不同程度的降解，所以测序得到的全长reads中，有很多是来源于同一条转录本的冗余序列，需要对全长序列进行聚类去冗余。

isoform 评估结果

可变剪接识别

可变剪接（Alternative Splice）是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。

可变剪接识别

Poly(A)尾长度估算

由于direct-RNA测序方式是从RNA 3’端到5’端测序，并且添加poly(T)接头的过程中完整的保存了poly(A)的信息，因此可以从direct-RNA测序的电信号中估算RNA分子的poly(A)尾长度。

不同基因及转录本的poly(A)尾长度

RNA甲基化分析

其他测序方式由于在建库测序过程中需要逆转录或者PCR，从而丢失了RNA分子中碱基修饰信息，而direct-RNA测序不需要逆转录或者PCR，意味着在测序过程中，经过表观修饰的碱基可以直接穿过纳米孔，在原始电信号中会产生与未发生修饰的碱基不同的电流特征。通过特定的软件算法对电流特征进行识别，即可鉴定碱基修饰信息。

甲基化位点电信号分布图

常见问题

1. Direct RNA建库 RNA最低起始量需要多少？

质量合格total RNA 40-80ug，浓度 ≥180 ng/μL。

2. Direct RNA 1个cell的产量大约是多少？

因为Direct RNA建库测序没有PCR扩增的过程，相对PCR cDNA全长转录组数据量偏低，高质量total RNA 我们可以承诺数量不低于1Gb。