翘首未来丨聚焦准确度,Oxford Nanopore 火力全开

通过之前的了解,我们已经知道Nanopore测序主要依赖于合成聚合物膜上的纳米孔,DNA/RNA链通过纳米孔时,产生电流信号,经base call可转化为碱基序列信息。从DNA/RNA链转换为碱基序列的过程中,化学试剂、测序模式、base call的准确度等方面都将影响到最终的碱基质量值(碱基质量值是衡量测序质量的重要指标,质量值Q越高代表碱基被测错的概率越小)。Oxford Nanopore Technologies(以下简称ONT)公司对于这些方面也做了一系列的开发和优化。在近日的Nanopore科研团体大会(NCM2018)上,Oxford Nanopore首席技术官Clive G Brown在会上展示了ONT团队针对Nanopore测序仪用户最关心的准确性问题做出的努力及研发成果,一起来看看在提升准确度方面ONT团队到底做了哪些升级吧~


图1 Nanopore测序示意图

从R9.4.1到R10

R9.4.1版纳米孔是目前Nanopore测序通用版本,有一个纳米孔通道,一个read head。R10 是一种新型的纳米孔,其纳米孔通道更长,具有两对Reader heads(图2)。这意味着可以产生更多的碱基控制信号以达到更高的准确度。在内部测试中,以75×覆盖度,新的R10纳米孔碱基质量值可超过Q40。ONT研发团队已开始着手于R10的测试工作,并发现了其中需要提升的部分。R10试剂有望在2019年早期公开发布。


图2 R9.4.1与R10版纳米孔

新的basecaller:flip-flop

这个基于flip-flop算法的basecaller软件同时适用于R9和R10版本试剂的测序数据,使用flip-flop重新识别现有数据(R9数据),碱基质量值可达到Q37。甲基化分析也被整合到了其中,现在已经允许使用R9.4进行5mC (CpG)的识别。这个软件将在12月中旬通过Guppy软件发布。ONT公司目前正在进行R10版本的工作,预计质量值可提升至Q42。用户可以通过http://bit.ly/2Q0EApc访问新碱基识别软件。

Linear Consensus Sequencing (LCS)测序模式

Clive勾勒了一个新的名为线性一致性测序(LCS)的方法。这种方法将一条链的数条拷贝结合在一起,通过一条读长进行测序,以获得更高的准确度。LCS测序模式保留原始模板链,可检测到链上的碱基修饰信息。

图3 线性测序Linear Consensus Sequencing (LCS)

8B4文库制备方法

8B4是一种新的文库制备方法,一个提升准确性的新文库制备方法可获取更丰富的信号。ONT公司目前正在精调8B4的碱基识别和共有序列方法。

1D2建库测序方式

1D2测序模式对DNA的两条链均进行了测序(图4),在保留碱基修饰的同时,提高单碱基准确率。1D2建库测序方式的更新将单条read准确度提高到了98%。新的1D2化学试剂含有带独特识别器(unique pairing identifiers, UPIs)的连接接头,支持用于扩增子测序。

图4 1D与1D2测序

ONT的这些更新将极大地提升Nanopore测序的准确性及碱基修饰的识别能力,使Nanopore测序的应用范围更加广阔,Nanopore测序技术将在动植物基因组组装、微生物基因组、全长转录组、结构变异检测及病原菌检测等领域具备独一无二的优势。

(内容整理自OxfordNanopore微信公众号)

参考链接:
https://mp.weixin.qq.com/s/ooZbJzsuAaeQQdBnN5lozg

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