Nanopore测序技术已进军Gb级别的番茄基因组领域

近日，研究者经Oxford Nanopore长读长测序技术完成了对预估基因组大小约为1G的野生番茄（Solanum pennellii）测序组装工作，文章发表于 The Plant Cell。经Nanopore测序技术组装的野生番茄LYC1722基因组，组装指标Contig N50高达2.5Mb，其基因组连续性、基因完整度及其他技术指标高于Illumina组装的番茄LA716基因组结果。结果表明Nanopore长读长测序技术以轻量级的预算已可完成Gb级别基因组的测序组装工作。

利用Nanopore测序技术的番茄基因组文章刚正式发表了，ONT 在Gb级别的动植物基因组组装情况如何？请看下文。

研 究 方 法

1. 研究材料：选择自交亲和的Solanum pennelliiLYC1722品种
2. Nanopore测序：共上机31个flowcells。

（1）长片段（12-80 kb，15-80 kb）筛选建库，(1D) ONT sequencing library (SQK-LSK108)，20 μg DNA/library，29 个ONT MinION flowcell (R9.4)

（2）未经片段筛选建库，24 μg DNA/2 library，2 个ONT MinION flowcell (R9.4)

研 究 结 果

数据下机情况

31个flowcell总产出为134.8G，flowcell产量在1.1-7.3G范围，大部分数据都是测序运行的24h内产生的（Figure 1），其中“Passed filter”为110.96G（基本上是预估基因组1-1.1G的100X测序量），过滤后的平均Q-score为7.44，在文库优化后的产出读长，过滤的平均读长在6,625-15,869bp间，最长read可达153,099bp。

Figure1 番茄Solanumpennelli 31个MinION flowcell测序产量情况

何种基因组组装策略最优？

为评估哪种组装策略对Nanopore在植物基因组组装效果更好，研究者经Canu、SMRTdenovo、miniasm及Canu-SMARTdenovo（经Canu校正过程和SMRTdenovo组装）几种组装策略对番茄基因组进行组装，发现Canu-SMARTdenovo组装效果最优：Contig N50 达2.45 Mb，Contig总数量为899，最大的Contig为12.32Mb，另外，每种组装策略对运算条件要求都各异（Table 1）。

Table1 番茄基因组Nanopore不同组装策略结果及纠错后组装结果

研究者提取了番茄基因组Nanopore数据量的40%，60%，80%数据，经miniasm，Canu，SMARTdenovo及Canu-SMARTdenovo进行组装测试，并经二代数据polish，发现Canu-SMARTdenovo组装效果始终最优（Figure 2）。另外，经片段筛分后构建的文库每个flowcell产出20Kb以上的读长占15%，而未筛分片段的文库产出20Kb以上的读长占3%，说明protocol的优化利于后续读长产出。

Figure2 番茄Solanum pennellii不同组装策略结果对比

番茄基因组组装质量如何？

经Nanopore原始数据组装的结果表现出明显的高错误率和高误差率，而经Nanopore-based polisher Racon或Nanopolish对错误率和基因覆盖改善效果不佳，而经Illumina数据对组装结果进一步Pilon polish，发现经Pilon迭代polish能有效降低组装结果的错误率和误差率，基因覆盖完整性提高到85%-96%（Table1， Pilon polished 5X）。同时结合其他番茄品种基因组及拟南芥基因组进行基因间比较发现，相对番茄Solanum pennellii LA716，番茄Solanum pennellii LYC1772基因组组装的完整性更完善。

此次番茄基因组Nanopore测序工作得到了高质量的番茄基因组，研究者最后粗略估算了下成本，对于这种中等大小的植物基因组（<2Gb）的Nanopore测序，在当时当地情况下，项目预算低于$25000，其他开销主要是计算资源，人力成本和耗损等。另一方面，Nanopore测序下机数据含有CpG甲基化数据信息，在不需要增加成本的情况下，可利用甲基化信息对物种进行深层次的表观关联研究。

参考文献

Schmidt M H W, Vogel A, Denton A K, et al. De novo Assembly of a New Solanum pennellii Accession Using Nanopore Sequencing[J]. The Plant Cell, 2017: tpc. 00521.2017.