Nanopore测序首次揭示RNA病毒天然基因组
Nanopore direct RNA测序是基于mRNA拥有poly(A)尾巴的特点进行测序的，其adapter是一段包含10个T的核酸序列，可与mRNA上的poly(A)序列互补，再连接测序接头，即可达到牵引mRNA到纳米孔进行测序的目的（Fig.1A）[3]。
A型流感病毒的RNA基因组3’端和5’端各有一段12nt和13nt的保守序列，研究者巧妙地设计了一种针对流感病毒基因组负链3’端保守区的Nanopore测序接头RTA（Fig.1B），从而实现了在Nanopore MinION上对流感病毒RNA的直接测序。
Fig.1 （A）Nanopore direct RNA建库测序示意图；（B）基于流感病毒保守序列Nanopore测序接头示意图
为了验证设计的RTA 的有效性，研究者应用Nanopore MinION对从已感染的鸡蛋尿囊液中提取的total RNA进行测序，结果表明该RTA接头可以特异性识别流感病毒RNA，通过Nanopore测序获得的序列能100%覆盖流感病毒基因组，且99%的序列可比对到流感病毒基因组。
Fig.2 MinION和MiSeq在原始样本中对PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS片段测序覆盖度比较
MinION测序数据对流感病毒中的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS等8个片段的覆盖度均为100%， 但3’端表现为更高的测序深度，说明测序是从3’端开始的（Fig.2）。研究还将MinION测序结果与MiSeq测序结果作了比较。
研究者指出，应用该方法还可以对在病毒生命周期中起重要作用的病毒mRNA和cRNA进行测序，这有可能识别和量化剪接类型并进行碱基修饰检测，而这些在以往的方法中是无法做到的。针对不同类型的RNA设计adapter并结合Oxford Nanopore测序可实现对RNA的靶向测序，大大增加了该技术的应用范围。
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参考文献
[1] Flu virus finally sequenced in its native form. Nature(2018)
[2] Keller M W, Rambo-Martin B L, Wilson M M,et al. Direct RNA Sequencing of the Complete Influenza A Virus Genome[J].bioRxiv, 2018: 300384.
[3]Garalde D R, Snell E A, Jachimowicz D, et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods,2018.
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