Next系列软件应用 | 桃金娘科首个T2T基因组研究成果公布

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）是一种重要的药用植物，成熟果实呈紫色。先前的研究初步确定了桃金娘中花青素的合成类型和药理作用。然而，很少有人研究桃金娘花色苷和其他生物活性物质。

研究思路

研究结果

1.桃金娘T2T无gap参考基因组

LFSTJN-1被选择用于T2T无gap参考基因组组装（图1A）。结果表明，桃金娘的基因组约为450.77Mb，杂合度为0.29%。使用Hifiasm对PacBio-HiFi数据进行组装，对于ONT数据使用NextDenovo进行组装，并用NextPolish软件对其进行纠错。在填补所有空白后，产生了一个470.35Mb的桃金娘无gap基因组，包含11条染色体，contig N50为43.80Mb。使用七个碱基端粒重复序列（’CCCTAAA’）作为序列查询，鉴定到所有22个端粒，并构建了桃金娘基因组的11个T2T伪染色体（图1C；补充表2）。11个伪染色体中都鉴定出着丝粒，长度在0.35Mb至3.49Mb之间（图1C）。

图1 桃金娘的基因组组装和基因组特征

NextDenovo/NextPolish软件是由希望组自主研发的三代测序基因组组装工具，在极大减少计算资源和运行时间的情况下，仍然能够组装出高质量基因组，具有高纠错、高效组装、高准确度的优势，已帮助众多科研人员进行基因组的组装以及文章的发表。

2.桃金娘基因组组装的质量评估

采用了多种数据和方法对桃金娘基因组进行组装。HI-C矩阵表明，11条染色体被充分和合理地组装（图1B），其数量与以前的记录一致。同时，调查和组装中使用的短读数和HIFI读数数据的比对显示出约99.96%和约99.93%的定位率。BUSCO评估表明，97.7%和99.0%的核心保守植物基因在组装中完整。长末端重复序列（LTR）的完整性测试显示，该组装的LTR组装指数（LAI）为16.16，与无gap组装类似。这些数据表明桃金娘基因组组装质量高。

3.桃金娘基因组进化

系统发育进化分析表明，桃金娘属和石榴属之间的分歧时间约为1437万年前（MYA），而953个和714个基因家族分别显示了桃金娘的扩张和收缩（图2A-B）。三种桃金娘科植物和石榴属植物之间的共线性分析表明，它们是完全连续的共线性。同时，在与桃金娘的比对中，巨桉（E. grandis，桃金娘科桉属）比番石榴（P. guajava，桃金娘科番石榴属）检测到更多的染色体倒置，这可能导致桃金娘科内部的分化（图2C）。

桃金娘科物种的同义替换位点（Ks）的分布在Ks≈1.25处达到峰值，这表明桃金娘与其他桃金娘科植物共享一个共同的近期WGD事件（图2D）。进一步确定了桃金娘科的WGD事件在66.58–95.50 MYA发生（图2A）。

图2 桃金娘与其他物种的系统发育和共线性分析

4.桃金娘器官间基因表达模式与果实软化相关代谢

为了探索桃金娘器官中的基因表达模式，研究者使用来自不同器官和发育阶段的10种类型样本中的25038个表达基因构建了加权相关网络（WGCNA）。先前关于番石榴的研究表明，果实软化和成熟的过程与细胞壁活性和淀粉降解有关。桃金娘是进一步探索桃金娘科肉质果实发育机制的良好材料。相关分析检测到器官和样本发育阶段高度相关的共表达模块（r>0.8）（图3A）。与番石榴相似，桃金娘的淀粉含量随着果实发育而降低（图3C）。根据KEGG注释，鉴定到桃金娘7个家族中的20个淀粉降解相关基因。相关基因的表达分析表明，淀粉-聚糖过程（GWD/ISA）基因主要在F1阶段表达（图3D）。F3和F4中鉴定出多个参与单糖或多糖代谢的高度特异性表达基因拷贝，包括RmAGL-1、RmAGL-2、RAMY-1和RMBAMM-5。此外，这些参与淀粉降解的基因在叶片或茎衰老过程中也高度表达。这与多种物种的器官老化过程一致。

图3 桃金娘不同组织中的基因表达模式及淀粉降解途径

图4 代谢产物丰度聚类和黄酮类化合物（主要是花青素分支）合成途径

6.桃金娘科植物果实的着色和花青素的积累

本研究用番石榴和桃金娘作比较，番石榴果实中的花青素合成活性没有增强，与番石榴果实的底色一致（图4D-E）。此外，对这两个物种的花青素合成下游途径的比较研究表明，OMT基因的CNV（拷贝数变异）是花青素糖基化所必需的。由串联重复拷贝数变化产生的两个基因拷贝（RmOMT 4/RmOMT-5）位于1号染色体末端（图5A）。表达分析表明，RmOMT-4的表达在果实中特异性增加，而RmOMT-5也在果实成熟的所有阶段表达，但在根部表达最高（图4D）。基于系统发育关系的亚家族分析表明，桃金娘中的GSTU亚家族基因多于番石榴（图5B）。该亚家族被证明参与花青素转运，值得进一步研究。

图5 分析基因拷贝数、MYB和GST基因家族系统发育、MYB差异表达基因以及正向选择基因

7.正选择的MYB基因对桃金娘花色苷合成的潜在影响

研究者发现番石榴中四个MYB基因的同源基因中没有检测到高表达（图5C）。系统发育分析表明，RmPAP1和RmPAP2与拟南芥中的PAP1（MYB75）PAP2（MYB90）以及AtMYB113聚集，其高表达已被证明可促进花青素合成。这两种MYB转录因子的共表达网络包含花青素合成途径中的九个基因（图5D）。同时，对桃金娘科植物中正选择基因的检测表明，这些基因包含32个MYB转录因子，包括RmPAP-2和RmMYB113。这种种间表达趋势的差异和花色苷的MYB调节因子进化中的正向选择可能会导致桃金娘的果实着色（图5E）。

本研究介绍了桃金娘科第一个无gapT2T基因组，确定了桃金娘花色苷的主要化合物及其合成途径。基因表达的模式分析和通路识别进一步丰富了对桃金娘肉质果实发育的认识。比较基因组和基因表达分析为果实中花青素的积累和着色提供了可能的机制。该基因组组装为研究桃金娘科肉质果实的起源和加速桃金娘的遗传改良奠定了基础。