未来组Direct RNA测序合作项目文章online啦！

2019年4月14日，中国科学院北京生命科学研究院、动物研究所及中国科学院大学等多家单位合作在RNA Biology（IF=5.216）上发表题为“Long-read direct RNA sequencing by 5’-Cap capturing reveals the impact of Piwi on the widespread exonization of transposable elements in locusts”的文章。Nanopore 长读长Direct RNA测序不需要经过反转录可获得完整的RNA转录本。该研究结果证明了5’-Cap捕获法的Direct RNA测序在描述包含重复序列的全长RNA转录本中具有重要作用。这是国内Direct RNA测序相关研究成果的首次亮相，武汉未来组承担了Direct RNA的建库测序工作。

内容摘要

飞蝗（Locusta migratoria）基因组较大，积累了大量的具有内在转录活性的转座子（TEs），TEs插入到内含子中被剪切机制识别，当做外显子添加到RNA转录本中的过程被称为外显子化。外显子化的TEs产生大量的高度相似的片段，运用短读长测序技术很难获得准确的全长RNA转录序列。本研究通过 5’-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本，通过Nanopore对RNA直接进行测序，以天然RNA形式描述飞蝗全长转录本特征。外显子化的TE包含大量的剪接供体和受体位点，有助于形成可变剪切转录本。研究者分析了蝗虫转录中TE外显子化模式，揭示了TE外显子化的广泛建立以及蝗虫转录组中TEs对RNA剪接的重要作用。此外，TEs的表达受Piwi蛋白的限制，分析Piwi表达对包含有TE衍生序列的RNA转录本图谱的影响，结果表明TE衍生序列是Piwi介导的抑制作用的主要靶点，Piwi的表达调控了包含TE衍生序列的RNA转录本长度，产生了可替代的UTR调控。

材料和方法

飞蝗（Locusta migratoria）基因组高达6.5 Gb， 其中转座子（TEs）序列占比高于65%，且大部分具有转录活性。因此，飞蝗可作为研究大型基因组TE结构和功能的理想模型。本研究以羽化的飞蝗为研究对象，通过 5’-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本，5’-生物素化的RNA转录本通过耦合的链霉亲和素免疫磁珠捕获。通过Nanopore对RNA直接进行测序（Fig.1）。

Fig.1  5ʹ-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本流程

主要结果

Nanopore Direct RNA测序作为一种新开发的技术只在少数几个物种中被应用。为了验证其在蝗虫中的可靠性，研究者测定了蝗虫转录组中转录本长度、序列一致性、Isoform覆盖度以及检测的基因数目，结果表明该测序方法可以精确获得蝗虫RNA转录本。

通过Fig.1所示的流程富集全长RNA转录本，RNA转录本5ʹ-末端合成的RNA接头（分为短接头文库和长接头文库）用作序列标签评估RNA转录本的完整性，短接头文库和长接头文库分别产生457,470和269,712条高质量reads。为了验证5ʹ-Cap捕获方法的有效性，研究者检测5ʹ-末端到3ʹ-末端接头的覆盖度，结果发现在长接头文库中大部分鉴定到的接头在5ʹ-末端，但是在长接头文库中5ʹ-末端没有接头富集（Fig.2a）。检测序列一致性及转录本比例，发现其均随长接头序列的减短（沿5ʹ-末端缩短）而增加（Fig.2b）。表明Direct RNA测序获得的RNA转录本5ʹ-末端的极端序列准确性较差。进一步使用长接头5ʹ-Cap富集文库的序列评估RNA转录本的基因覆盖度，编码区和非翻译区域整体覆盖度很好（Fig.2c），表明5ʹ-Cap捕获方法的Direct RNA测序可以获得全长CDS。

Fig.2  5ʹ-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本效果验证

2. 大量的RNA转录本包含外显子化的转座子序列

以最长的RNA转录本作为每个转录本单元的代表序列，在60,908条代表序列中，51.88%（31,599）至少包含1个TE衍生序列，TEs序列长度占整个蝗虫转录组的19.94%。其中，37.45%为DNA转座子，32.93%为non-LTR 逆转录转座子，29.63%为LTR 逆转录转座子（Fig.3a）。家族间的频率分析表明，没有一个特定的家族主要促使其他家族成员的TE共现（Fig.3b）。由此可见，在大部分的RNA转录本中可观察到TE衍生序列的外显子化，并且不同的TE家族对蝗虫的RNA转录本作用不同。进一步分析发现，与5ʹ-UTR和3ʹ-UTR区域相比，编码区显示对TE外显子化更强的选择，而相比于3ʹ-UTR，5ʹ-UTR对TE外显子化更容易（Fig.3c）。

Fig.3  蝗虫转录组TE事件

3.Piwi的表达影响包含TE衍生序列的RNA转录本的长度

80%以上包含TE衍生序列的RNA转录本被认为是蝗虫的转座子，大量的转座子随着Piwi的沉默表达量上调（Fig.4a），RNA干扰的Piwi表达对蝗虫转录组中编码基因的表达有重要影响。dsPiwi样本TE衍生序列的覆盖度高于dsGFP样本，表明dsPiwi样本TE衍生序列内含物水平更高（Fig.4b）。为了探明TE衍生序列产生的可变剪接事件是否与dsPiwi样本更高水平的内含物有关，研究者检测了可变外显子中的TE衍生序列，只有少数（9.82%）可变剪接事件与TE衍生序列有关，大多数（96.88%）TE衍生序列的外显子在dsPiwi和dsGFP中均有发现（Fig.4c），表明可变剪接不是dsPiwi样本更高水平内含物的主要因素。进一步研究发现dsPiwi样本中双表达包含TE衍生序列的RNA转录本长度显著高于dsGFP样本，但是，双表达不包含TE衍生序列的RNA转录本长度在两个样本中没有显著差异（Fig.4d）。dsPiwi样本和dsGFP样本中蛋白编码转录本序列长度的差异主要是由于5ʹ-UTR和3ʹ-UTR区序列的变化而不是CDS区域序列的变化引起的，暗示了由Piwi表达介导的可替代的UTR调控。

Fig.4  Piwi RNA沉默后TE表达活性增强

总之，该研究结果证明了5’-Cap捕获法的Direct RNA测序在描述包含重复序列的全长RNA转录本中具有重要作用。

参考文献

Feng Jiang, Jie Zhang, Qing Liu, Xiang Liu, Huimin Wang, Jing He & Le Kang (2019): Long-read direct RNA sequencing by 5’-Cap capturing reveals the impact of Piwi on the widespread exoniza- tion of transposable elements in locusts, RNA Biology, DOI:10.1080/15476286.2019.1602437