项目文章 | Nat Commun! 利用ONT测序揭示基因组结构不稳定性驱动piRNA进化历程以保护基因组完整性的机制

近日，美国罗切斯特大学医学中心生物化学和生物物理学系RNA生物学中心联合西北农林科技大学动物科学与技术学院、加拿大麦吉尔大学在Nature Communications杂志发表了题为“Amniotes co-opt intrinsic genetic instability to protect germ-line genome integrity”的论文。论文通过对鸡、鸭、小鼠和人类的比较研究，以及对不同品种鸡的长读长纳米孔测序，揭示了粗线期piRNA的功能，以及其快速进化历程。

美国罗切斯特大学的孙禹，西北农林科技大学的崔宏晓，美国俄亥俄州立大学的宋驰和浙江大学医学院附属第四医院的沈加飞为并列第一作者，加拿大麦吉尔大学的赵辛和美国罗切斯特大学的李鑫为共同通讯作者。希望组梁帆、陶庆参与了该项研究工作。

研究思路

01鸟类粗线期piRNA迅速分化

为了揭示鸡piRNA的表达图谱，研究者通过收集鸡（雅典加拿大肉鸡随机繁殖品系，ACRB）在八个关键发育阶段（第1天至30周性成熟；图1a，i）的睾丸组织，分析了第一波精子发生过程（图1a，i）的RNA变化。大多数piRNA在12至18周的过渡期表达（图1a、ii和iii），即精子发生第一波过程中减数分裂的时期。这一阶段与CIWI的mRNA表达一致（图1a，iv），CIWI是一种PIWI家族基因，其在小鼠中的同源基因与粗线期piRNAs特异性结合。研究者还检测到粗线期精母细胞胞浆中CIWI蛋白的阶段特异性染色（图1b），并绘制出了八个发育阶段中每个piRNA基因座的piRNA丰度，发现在粗线期检测到大量表达，而在早期阶段几乎没有piRNA（图1c），表明成年睾丸中的大多数piRNA都是粗线期piRNA。与哺乳动物粗线期piRNA类似，成年鸡睾丸中的大多数piRNA不是来自重复区域或基因区域（图1a，iii）。这些结果表明鸡中存在粗线期piRNA，而且粗线期piRNA在鸟类和哺乳动物生殖细胞发育过程中大量表达。在功能水平上，虽然在鸭睾丸中检测到大量的piRNA，但与鸡piRNA基因座同源的136个基因座并不产生piRNA（图1d）。研究者得出结论，哺乳动物和鸟类粗线期piRNA的共同特征是快速分化。考虑到与哺乳动物基因组相比，鸟类基因组在核苷酸序列、基因共线性和染色体结构方面表现出高度的进化停滞，piRNA在哺乳动物和鸟类之间的快速分化是其进化的共同特征。

图1 鸡粗线期piRNA的存在

02piRNA基因座是鸟类和哺乳动物的结构变异（Structural variation，SV）热点

研究者使用ONT进行测序，并达到每只鸡31X的测序深度。与未驯化野生鸡的参考基因组相比，每只家鸡共发生17321±777次SV事件（图2a，b）。虽然piRNA基因座仅占鸡基因组的0.98%，但SV发生在粗线期piRNA基因座的频率更高：12.4%的串联重复、19.4%的倒位、1.7%的缺失和1.2%的插入与piRNA基因座位重叠（图2a，iii）。同时发现，在piRNA基因座中，串联重复、倒位和缺失的富集是显著的（图2c）。

piRNA基因座中的SV也与piRNA在表达量（图3a）、正义/反义链表达方向（图3b）和不同piRNA序列的相对丰度（图3c）的变化相关。研究者量化了piRNA丰度、链偏向性和香农多样性指数的个体差异，发现piRNA基因座内的SV区域显著高于缺乏SV的piRNA基因（图3d）。因此，与SV热点重叠与piRNAs的快速分化相关。

图2 鸡piRNA位点是SV热点

图3 实现piRNA可塑性的保守机制

03piRNA位点与SV热点重叠的收敛进化

研究者设想了导致piRNA基因座和SV热点之间关联的三种可能机制（图4a）：（1）piRNA基因和SV热点独立起源，它们的重叠是在共同选择压力下趋同进化的结果（收敛假说）；（2） SV热点首先出现，增加了基因组区域进化为piRNA基因座的机会（突变假说）；以及（3）保守的分子机制将piRNA的生成与SV的形成联系起来（保守假说），例如piRNA的产生导致基因组不稳定性或SV造成的DNA损伤触发了piRNA的形成。研究者发现与随机打乱的基因组序列相比，鸡piRNA位点对转座子（Transposable element，TE）的富集显著，但节段重复（Segmental duplication，SD）相对缺失（图4b）。总之，该数据表明，鸡、小鼠和人类piRNA基因座上的SV热点是独立形成的，由不同的突变机制导致（图4c）。因此，趋同进化导致SV热点和粗线期piRNA基因座在鸟类和哺乳动物的基因组中重叠。

图4 趋同进化驱动了SV热点和粗线期piRNA位点之间的关联

04粗线期piRNA的保守功能是抑制活跃的转座子

与基因组的其余部分相比，小鼠和人类粗线期piRNA基因座中的活跃TE序列并没有更少：小鼠的比例为1.6%，人类为1.0%（图5a）。研究者利用了Mov10l1突变体小鼠进行研究，该突变体可以正常进行减数分裂，但在圆形精子细胞阶段停止发育。在对圆形精子细胞成像发现，Mov10l1突变体中有8±2个γH2AX聚焦点（DNA损伤的标志物），而野生型细胞则没有任何聚焦点（图5b)。利用RNA-seq发现，尽管83%的TE家族（1223个家族中的1020个）的表达没有改变，但大多数活跃TE家族的表达在Mov10l1突变体睾丸中显著增加（图5c）。通过对Mov10l1突变体睾丸中的piRNA Ping-Pong信号分析显示，靶向这些TE的piRNA引导的切割显著减少（图5d），从而表明Mov10l1突变体睾丸的TE是被靶向TE的粗线期piRNAs所抑制。尽管只有2.4%的鸡粗线期piRNA基因座编码活跃的TE，但所有活跃的TE家族都被粗线期piRNA靶向（图5e）。

图5 抑制活跃转座子是粗线期piRNA的保守功能，同时也驱动了粗线期piRNA进化

05piRNA变异和有害SV之间的适应性平衡

与不产生piRNA的其他SV热点相比，研究者发现piRNA基因座与人类和鸡的蛋白质编码基因显著更接近（图5f），表明源自piRNA位点的SV比其他SV热点更可能损害蛋白质功能。人染色体15q上的多个致病性SV位点就是一个典型的例子（图5g）。这些SV仅在年轻的piRNA基因座中富集，这表明它们不会在长期进化过程中被选择下来。因此，粗线期piRNA基因座比其他SV热点更有害，SV热点通过产生新的piRNA来保护基因组完整性的功能产生的益处使得源自piRNA基因的SV在体细胞中的致病作用是可以忍受的。