一项基于PacBio的目标区域测序技术：PacBio-LITS（三代测序那些事儿 第九期）

最近有很多老师询问我们是否可以用PacBio SMRT 长读取技术只对他们感兴趣的基因组区域进行测序，也就是我们常说的目标区域测序，这样一方面节约了研究成本，另一方面也是更重要的一点，解决了基于NGS（传统二代测序）的目标区域测序所遇到的基因组复杂区域的组装及结构变异检出的问题。

该技术确实是可行的，Bayler医学院已经开发了基于NimbleGen 靶向捕获富集技术的PacBio目标区域测序技PacBio-LITS， 其中NimbleGen获技术是由Roche公司开发，可以几天内捕获连续或分散的 5Mb或30Mb基因组区域。该研究成果发表在今年3月份的 BMC Genomics。

对于该技术，我们（Nextomics）还处于研发阶段，参考了贝勒医学院的PacBio-LITS技术思路，成熟产品推出可能还需要些时间，但研发期间我们欢迎合作伙伴的加入。

PacBio-LITS 解读

相关文献：

PacBio-LITS: alarge-insert targeted sequencing method for characterization of humandiseaseassociated chromosomal structural variations .

PacBio– LITS技术路线

gDNA随机打断（g-TUBE）→BluePippin分选→NimbleGen捕获→LM-PCR→PacBio建库测序。见图1

                                                                图1：PacBio – LITS workflow

PacBio-LIST技术论证

研究人员总共制备了5个NimbleGen捕获文库，来自3个个体（HS1011、BAB1123、NA12878）。

捕获过程中使用了两种类型的探针：SMS/PTLS与MHC。其中SMS/PTLS是针对 Potocki-Lupski综合征（PTLS）、Smith-Mangenis综合征（SMS）相关区域设计，捕获区域为17号染色体短臂上的一段7Mb区域。MHC为针对人类HLA基因区域设计，区域大小为4.97 Mb。

HS1011构建了一个~4kb的MHC捕获文库。

NA12878分别构建了一个~6kb的SMS/PTLS捕获文库和一个~4kb的MHC捕获文库。

PTLS个体BAB1123构建了~1kb与~4kb两个SMS/PTLS捕获文库。

使用PacBio RSII对捕获文库进行了测序，各得到~800Mb数据，使用试剂为P5C3。

对测序结果统计显示，~6kb的捕获文库（NA12878，SMS/PTLS）的捕获率最高，~73%（目标区域的reads比对率），平均subreads长度为2.4kb。其次为BAB1123 的~1kb与~4kb SMS/PTLS捕获文库，捕获率分别为69%、65%，平均subreads长度分别为2.2kb与770bp。两个MHC捕获文库捕获率较差，均为~50%。

该结果表明较大的捕获文库较长的reads长度有着更高的捕获率。

PacBio-LITS检测PTLS个体致病区域 17p 11.2 结构变异情况

研究者分别为3个PTLS个体BAB2714、BAB2695、BAB3793构建了~4kb捕获文库，使用了针对17p11.2区域的SMS/PTLS系列探针（NimbleGen），捕获区域大小为7Mb。

将测序数据比对回人类参考基因组GRCh37，利用针对PacBio数据开发的结构变异检测工具PHhoney发现了存在于BAB2714、BAB2695、BAB3793的17p11.2区域的染色体重排现象（也得到了Sanger测序结果的验证）。

其中在BAB2714与BAB3793中发生了LCR（low copy repeat）介导的倒置重排，BAB2695中发生了Alu介导的染色体重排。

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