未来组再破纪录!ONT细菌混测数据惊艳亮相

未来组11个细菌Nanopore混测数据惊艳亮相

三代测序平台一个cell动辄几十上百Gb的数据产出,可是细菌基因组那么小,不需要那么多数据,怎么办?

给多个细菌样本分别添加barcode序列,同时配合Nanopore长读长测序技术,可通过一次测序获得多个细菌的基因组序列,在保证质量、效率的同时大大降低测序成本!

Fig.1 Nanopore barcode 测序流程

那么多细菌数据搅和在一起,不会搞混吗?还是不用担心,经过未来组研发团队的不懈努力,基于Nanopore PromethION平台的细菌混测研发取得了骄人成绩——单个flowcell混测11个细菌,总产出数据量达97Gb,barcode 拆分效率将近90%!

与此前曾发表的细菌Nanopore混测研究只有65.5%的拆分率相比,我们的总产出及拆分率均大大提升!(友情链接:Nanopore混测1cell,一次性解决12个细菌完成图

Fig.211个细菌混测拆分统计

Table 1 11个细菌Nanopore混测数据展示

平均每个细菌数据量均超过了5Gb,且Reads N50值甚至超越了24Kb,无论是测序深度还是读长都为后续的细菌基因组完成图打下了坚实的基础!

Fig.3 细菌基因组圈图示例

由外到内依次为编码基因(正义链)、编码基因(负义链)、tRNA(橙色)和rRNA(紫色)、CRISPR(蓝色)和基因岛(绿色)、GC比、GC-skew、测序深度。

基因组学盛会开幕,未来组诚邀您加入

秋收十月,瓜果飘香,在基因组学领域耕作了一年的学者们也到了分享累累硕果的时节!

可可、咖啡和茶是享誉世界的三大无酒精饮品,几乎俘获了所有文化背景的人群,还催生出专门讨论它们的国际学术会议!这不,“第一届可可、咖啡和茶(亚洲)国际学术大会”(First International Congress on Cocoa Coffee and Tea Asia)即将于2018年10月17-20日在合肥拉开帷幕,想参加了吗?说不定还可以品尝到这些饮品呢!

本次会议是“国际可可咖啡茶大会”组委会首次授权在亚洲举办,并确定会议交流内容以茶叶相关研究为主。会议交流的主要议题为:三大饮料作物的生理生态与种质创新、次生代谢与品质化学、健康功能及作用机制和质量安全与加工利用。

本次国际学术大会将为国际上与茶、咖啡和可可密切相关的科学家们提供重要学术交流机会和报告最先进的科学成果,并促进世界上三大饮料在科学研究与技术研发上的交叉融合,让我们拭目以待吧!

同时,为了展示我国植物生物学研究的最新成果和进展,促进植物科学发展、助力乡村振兴,加强相关领域科研人员之间的交流与合作等,中国作物学会、中国植物学会、中国植物生理与植物分子生物学学会、中国遗传学会、中国细胞生物学学会联合举办“2018全国植物生物学大会”。大会定于2018年10月18日-22日在山东泰安召开,将邀请国内植物生物学相关领域取得突出成果并具有重要学术影响的专家学者以及优秀青年科学家进行学术报告,欢迎感兴趣的小伙伴们赴会!

植物基因组往往因其古老的起源、复杂的演化史而对研究造成颇多障碍,尤其是复杂倍性、杂合度的作物更让研究者望而生畏。武汉未来组基于三代测序平台(PacBio和Nanopore)、BioNano光学图谱和Hi-C染色体构象捕获技术,并搭载天河II号、阿里云和华为云等服务器,已完成多种植物基因组及转录组测序项目,如玉米、木棉、水稻、棉花、杜仲、矮牵牛等,合作研究成果已有多篇发表于国际知名学术期刊。

组学君诚邀您莅临未来组展位,未来组将为您展示最新的三代测序技术及其应用成果,为组学领域研究提供新思路!

第一届可可、咖啡、茶(亚洲)国际学术大http://cocotea-asia2018.csp.escience.cn/dct/page/1

2018全国植物生物学大会http://www.ncpb.net/2018/index.php/News/show/id/36.html

ONT开启微生物组学的黄金时代

微生物是地球上最丰富、最多样的生命形式,它们是所有生态系统的重要组成部分,在医疗健康领域和工业应用领域中发挥着至关重要的作用。微生物基因组学研究在医学上可应用于致病相关基因的鉴定、开发新型抗生素等,而在生物技术上可用于生物降解、酶工业、食品生物以及抗生物质的研究,同时对进化、功能预测等方面也有着重要意义。

自1994年美国发起微生物基因组研究计划(MGP)以来,微生物组学在生物领域蓬勃发展,而在2001年中国绘制出首张微生物基因组“完成图”以后,随着高通量测序技术的诞生,微生物基因组研究也进入了井喷期,我国先后启动了万种微生物基因组计划、百万微生态系统基因组计划等。

研究的深入依赖技术的进步。短读长测序技术由于无法跨越富含重复区域的基因组使得很多微生物研究止步于基因组草图,而长读长测序技术却可以轻松获取细菌基因组完成图,同时在复杂微生物群落的鉴定中可达到“种级别”的鉴定水平。Frank等人于2016年结合Hiseq2000和PacBio RS II对沼气反应器内微生物宏基因组进行研究发现PacBio技术能显著提升组装水平[1],而2013年Chin等仅运用PacBio就组装出16个微生物基因组,与参考基因组一致性达99.9999%[2]。

如果说PacBio技术为微生物研究打开新世界的大门,那么基于纳米孔电流检测的ONT技术则开启了微生物组学的黄金时代!

全基因组从头组装

案例1:野生型酵母全基因组从头组装[3]

2017年,荷兰研究者Jansen等人分离出了DDNA#1和Saccharomyces cerevisiae S288C两种酵母菌株DNA,使用Illumina和Nanopore MinION测序方式分别进行测序,在获取基因组数据后对DDNA#1使用了三种方式进行组装,ONT的优势不言而喻:

①使用Illumina平均~240bp读长的1.08G数据进行组装,组装出14,764条contigs,contig N50仅2.2K;

②使用Illumina和使用canu组装、校正的ONT数据进行混合组装,得到了1904条contigs,contig N50位255K。值得一提的是,这里的ONT数据只包含canu从2.05G原始数据校正后得到的389M。

③使用ONT数据并使用canu以Illumina短reads进行校正,最后组装出仅仅61条contigs,contig N50达到455K。

有意思的是,研究还将两种MinION测序芯片R7.3和R9对DDNA#1线粒体基因组中AT含量富集的一个区段的测序组装结果和Candida vartiovaarae线粒体基因组进行比较,发现升级后的芯片R9表现要好得多(如Fig.1所示)。

Fig.1 两种MinION芯片数据组装的DDNA#1线粒体基因组覆盖情况

最后,研究还将组装的DDNA#1基因组和其他酵母的基因组进行了比较,得出了野生型酵母杂合度较高的结论,并指出ONT数据对于酵母菌株分类的可靠性,而且,使用ONT结合其他测序平台的数据对基因组注释也颇有助益。

群体遗传分析

案例2:酵母基因组从头组装及群体遗传变异研究[4]

法国Genoscope的研究人员同样利MinION对Saccharomyces cerevisiae S288C菌株进行测序来评估ONT组装的有效性,从头组装了代表S. cerevisiae遗传多样性的21个菌株,分析表明ONT数据组装出的基因组连续性比仅用Illumina组装出的高出14倍,且有65%的染色体仅含1—2条contigs。

同时,研究也对S288C菌株也进行了ONT测序,并利用Illumina reads进行校正,22个菌株组装得到的基因组结果如Table 1所示,基因组大小介于11.83Mb到12.2Mb之间。菌株CEI的Contig数最少(18个),平均Contig数为27.5,组装结果都较完整。

Table 1 使用SMARTdenovo组装的22个菌株连续性情况

接着,研究者将组装得到的基因组与已知的酵母TE家族(Ty1-Ty5)进行比对,发现S288C组装注释的50个 TEs有47个都在染色体的正确位点,表明Nanopore策略组装的基因组用于鉴定TE准确性较高。得益于ONT数据可以确定串联基因的拷贝数,研究在组装基因组中搜寻到了CUP1和ENA1-2两个关键的串联重复基因并发现其在21个菌株中极其分化,除此之外还分析了易位和倒位等更大的结构变异。研究者借此也表明,结构变异检测的准确性高度依赖组装的完整性。最后,研究还分析了菌株间线粒体基因组的变异,将它们比对到参考序列上比较分析了检测到的SNPs、插入-缺失、重复区域、基因间区变异等。

特有基因快速检测

案例3:Nanopore检测肠杆菌抗生素耐药性基因[5]

研究从20个污水处理厂收集的样本中鉴定出具有抗生素耐药性的9种肠杆菌科细菌,并检测出其中三种主要的抗生素酶A、B、D,在进行Illumina全基因组测序后与耐药性基因数据库进行比对找到了三种酶对应的抗生素,发现三个对某种抗生素具有高耐药性的菌种都含有blaOXA-48基因。

研究在单独检测Illumina数据时没有组装到blaOXA-48基因,只能定位到其处于三个组装基因组上的三个不同长度的contig上。于是研究人员又进行了Nanopore MinION测序,不仅首次组装出了Enterobacter kobei的基因组完成图,而且另两个菌种的基因组也都是高质量的,借此组装出了三个菌种编码blaOXA-48基因的质粒。

Table 2 基于Illumina和MinION数据对九种菌种基因组的组装统计

跨越重复序列

案例4:ONT挑战长重复序列原核生物基因组组装极限[6]

假单胞菌Pseudomonas koreensis P19E3的基因组含有长达70Kb的重复序列,以及变异的shufflon区域,即便是使用PacBio测序也难以获得满意的组装结果。研究者使用读长更长的Oxford Nanopore测序技术,完成了对Pseudomonas koreensis P19E3的基因组组装,论文发表在Nucleic Acids Research上。

该研究分别采用不同的测序技术对P. koreensis P19E3进行测序,获得的reads结果如Table 3所示,PacBio reads N50为16.9 Kb,而ONT reads N50则高达44.9 Kb。

Table 3 三种测序技术基本数据

利用PacBio数据,HGAP3软件组装得到14条contigs,Flye组装得到7条contigs,都不能得到P. koreensis P19E3的基因组完成图。而利用ONT数据则组装得到一条6.44Mb大小的染色体和4个质粒,将P. koreensis P19E3基因组完整组装出来。同时,制约P. koreensis P19E3基因组完成图的另一主要障碍是高重复的shufflon区域,利用ONT数据和Flye软件也很好的破译了该区域序列。

参考文献

[1] Frank JA, Pan Y, Toomingklunderud A, et al. Improved metagenome assemblies and taxonomic binning using long-read circular consensus sequence data[J]. Scientific Reports, 2016, 6:25373

[2] Chin CS, Alexander DH, Marks P, et al. Nonhybrid, finished microbial genome assemblies from long-read smrt sequencing data[J]. Nature Methods, 2013, 10(6):563-569.

[3] Jansen HJ, Dirks RP, Liem M et al. De novo whole-genome assembly of a wild type yeast isolate using nanopore sequencing, F1000Research 2017, 6:618 

[4] Istace B, Friedrich A, D’Agata L, et al. de novo assembly and population genomic survey of natural yeast isolates with the Oxford Nanopore MinION sequencer[J]. Gigascience, 2017, 6(2):1-13.

[5] Ludden C, Reuter S, Judge K, et al. Sharing of carbapenemase-encoding plasmids between Enterobacteriaceae in UK sewage uncovered by MinION sequencing[J]. Microbial Genomics, 2017, 3(7).

[6] Schmid M., et al. Pushing the limits of de novo genome assembly for complex prokaryotic genomes harboring very long, near identical repeats, Nucleic Acids Research, gky726,https://doi.org/10.1093/nar/gky726.

SVs识别哪家强?PromethION为您揭晓

继PacBio首次确认一种疾病大片段缺失突变【1】引起广泛关注后,人类基因组结构变异联盟又分别用Illumina、PacBio以及Bionano对人类基因组结构变异(SVs)进行分析【2】,而未来组兄弟公司希望组则瞄准ONT平台的潜力,通过GridION在一例全外显子组检测阴性患者中准确的鉴定出基因组结构变异,为胚胎植入前遗传学诊断提供重要参考【3】。近日,预印本在线期刊bioRxiv也发布了一篇比利时安特卫普大学De CosterWouter等人的研究成果,详细地比较了ONT平台的MInION和Prometh ION在检测人类基因组结构变异上的实力【4】。

本研究通过对两种平台数据SVs的高灵敏性识别以及对最优参数的比较,发现比对软件Minimap2 和SVs识别软件Sniffles是最精确也最有效率的工具,同时研究还给出了从个体或群体的长读长基因组中鉴定、注释并描述数以万计SVs的流程(https://github.com/wdecoster/nano-snakemake/),最后还对长读长测序研究鉴定SVs的未来做了展望。

为什么用长读长测序技术检测SVs?

SVs包含拷贝数变异(CNVs、缺失和复制)、插入、倒位、易位、移动元件插入、重复序列扩张甚至上述情况的组合。目前,使用短读长测序技术对大部分SVs的识别都不太理想,主要因为有些插入变异长度超过了测序技术的读长,有些是富含GC区域,对本身有测序偏好的技术产生困难。有研究人员评估基于短读长技术的变异检出算法错过了约77%的插入,而PacBio在检测结构变异上的灵敏度是Illumina的三倍【2】。ONT平台的MinION有512个通道,最新产能达到30G,用于人类基因组的测序需要多个MinION并行且耗资不菲,而拥有多达3000个通道、12000个纳米孔的PromethION则完美的解决了这个问题。

本研究使用了5个PromethION flowcells覆盖了人Yoruba NA19240深度为59×的基因组,最长read为177Kb,MinION测得的最长read为219Kb(见Table 1)。因为文库打断为20Kb的片段后产量会更高,因此结果反映出了产量和读长的反比关系。

MinION VS PromethION

MinION和PromethION两个平台产出数据的读长近似,但是在和参考基因组GRCh38比对后发现MinION产出数据的平均质量分数和一致性要略高一些(见Figure 1)。

比对工具比较

接着,研究又比较了ngmlr、LAST以及两种参数设置下的minimap2这三个比对软件,LAST产生了很多分离的比对序列导致比对上的reads较短,而minimap2运行速度最快,LAST最耗时,另外,一致性比例和比对覆盖度中值较为一致(见Table 2和Figure 2)。

SVs识别

研究又使用Sniffles和NanoSV分别对SVs进行calling,并在识别插入时还使用了nplnv,三种工具分别在上述四种比对软件的结果下运行,最后发现Sniffles是目前评估SVs最快速的工具(见Table 3)。

研究者还对上述比对和SVs识别工具进行组合以评估、识别鉴定出来的SVs,结果显示在使用minimap2比对后Sniffles软件表现出更高的精确性。同时,研究还评估了Sniffles、NanoSV以及nplnv识别的倒位,nplnv得到的结果最佳。另外,研究评估了SVs的长度以及准确度并且描述了鉴定到的变异。

最后,在鉴定到SVs后,研究者还注释了重叠基因、重复片段等信息,研究表明重叠基因与判别这些变异的致病性相关,非编码区的SVs的影响目前还不明确,而位于重复片段上的SVs注释则扮演着双重角色,一方面它们是SVs形成的热点区域,另一方面对于比对造成重重困难,显著的增加了变异识别的假阳性。

该研究最后展望了长读长测序检测基因组SVs的前景。SVs让人类基因组呈现更高的多样性,越来越多的研究表示以前的人类基因组数据低估了SVs的数量及其在健康、疾病中的作用,少数较大的变异会导致许多遗传病疾,据悉,非编码区的结构变异也是潜在驱动突变的因素【5】。

由于大小所限,SVs并不能像单核苷酸变异(SNV)那样通过短读长技术来研究,而低深度的长读长覆盖就能够挖掘有用的结构变异信息【1】。为区分出那些致病的SVs,研究者们还需要从多个群体着手对SVs进行综合性分类,研究人员在这一领域还大有可为。相信,以PacBio和ONT为代表的长读长测序技术将在SVs的研究上发挥不可或缺的重要作用,尤其是PromethION,其超长读长和超高产能的特性都已经让其成为众多组学领域的首选。

参考文献

【1】Merker J D, Wenger A M, Sneddon T, et al. Long-read genomesequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease.[J].Genetics in Medicine Official Journal of the American College of MedicalGenetics, 2017, 20(1).

【2】Chaisson M JP,Sanders A D, Zhao X,et al. Multi-platform discovery ofhaplotype-resolved structural variation in human genomes.[J].  bioRxiv preprint first posted online September. 23, 2017.

【3】Hefan Miao, Jiapeng Zhou, Qi Yang,et al. Long-read sequencing identified a causal structural variant in anexome-negative case and enabled preimplantation genetic diagnosis. bioRxivpreprint first posted online May. 21, 2018.

【4】Coster W D,Roeck A D, Pooter T D, et al. Structural variants identified by OxfordNanopore PromethION sequencing of the human genome. bioRxiv preprint first posted online October. 3, 2018.

【5】Dixon J R,Xu J, Dileep V, et al. Integrative detection and analysis ofstructural variation in cancer genomes. Nature Genetics50, pages1388–1398 (2018).

气候变化还能改变基因组大小?

两栖动物是动物发展历程中的关键群体,作为第一批登陆的脊椎动物,在动物从水生到陆生的进化过程中起着“承先启后”的重要作用。两栖动物能在陆地存活,但无陆地繁殖的本领,是一群过渡类群,这种独特的生命史使其对气候变化十分敏感。

众所周知,基因组记录了物种的遗传信息,物种的进化必定是建立在基因组的进化之上,于是人们很自然地把基因组的大小与物种在进化上的复杂程度相关联起来。然而它们的演化轨迹是否完全一致呢?在漫长的进化史中又有哪些因素会导致基因组大小的变化呢?为了解开基因组大小演化中的这个谜题,西班牙和英国研究者通过大规模的两栖动物发育系统及多种进化模型研究了两栖动物生命史,揭示了影响两栖动物基因组演化趋向的关联因素并且发现气候变化可间接影响两栖动物基因组大小,论文于近日发表在nature ecology & evolution上。

两栖动物是动物发展历程中的关键群体,作为第一批登陆的脊椎动物,在动物从水生到陆生的进化过程中起着“承先启后”的重要作用。两栖动物能在陆地存活,但无陆地繁殖的本领,是一群过渡类群,这种独特的生命史使其对气候变化十分敏感。

众所周知,基因组记录了物种的遗传信息,物种的进化必定是建立在基因组的进化之上,于是人们很自然地把基因组的大小与物种在进化上的复杂程度相关联起来。然而它们的演化轨迹是否完全一致呢?在漫长的进化史中又有哪些因素会导致基因组大小的变化呢?为了解开基因组大小演化中的这个谜题,西班牙和英国研究者通过大规模的两栖动物发育系统及多种进化模型研究了两栖动物生命史,揭示了影响两栖动物基因组演化趋向的关联因素并且发现气候变化可间接影响两栖动物基因组大小,论文于近日发表在nature ecology & evolution上。

Fig. 1 两栖动物系统发育树

已有的研究表明,基因组大小与细胞核大小、营养物需求、生命周期复杂性、基础代谢、细胞周期、组织分化和发育速率等有关。该研究通过系统发育方差分析表明,生命周期复杂性与基因组大小之间没有显著相关性(Fig. 2a,2b)。在有尾目中,幼形遗留物种基因组大小与非幼形遗留物种之间亦没有显著差异(Fig. 2c)。由此表明,两栖动物基因组大小与是否有幼虫发育阶段无关,反驳了早期基因组大小与是否存在变态发育有关的研究结论。

Fig. 2 两栖动物基因组大小进化的祖先状态重建表征图

为了检测基因组进化速率随着时间的推移在两栖动物不同目之间的差异,明确有尾目特征空间的变化是自发变化还是突变进化的结果,研究者采用BAMM算法估计基因组大小进化速率,结果表明,有尾目基因组大小进化较无尾目更慢(Fig. 3a),蚓螈目处于中间状态,且随着时间的推移,到现代有尾目进化速率下降,而蚓螈目和无尾目进化速率均有缓慢的增加(Fig. 3b)。进化模型拟合表明,无尾目和蚓螈目的基因组是在共同的Brownian motion过程下进化的,而有尾目基因组的进化过程则截然不同。

Fig. 3 两栖动物三个目的基因组大小进化速率评估

环境温度是变温动物生理机能的重要决定因素,影响细胞复制、代谢和发育。而已有研究表明快速发育导致无脊椎动物基因组大小的减小,因此推测环境温度的变化可能在基因组大小进化中具有重要作用。该研究结果表明,在无尾目和有尾目中,环境和生活史相关,高温和干旱显著减少其发育时间。在无尾目中,基因组大小与发育周期相关,短的发育周期其基因组也较小。由此可见,气候变化可间接影响两栖动物基因组大小。

在整个生命之树中,基因组大小的显著变化是随时间渐进式进化导致的还是间断式进化的结果一直存在争议。研究认为这两个过程都有贡献,尽管当间断事件发生的时候可能会对基因组大小进化的整体模式产生深远的影响,但是间断事件罕见。研究也推测Brownian-motion-like的进化模式可能是分子过程相互作用的结果,主要是转座子含量的变化,其可导致多倍化或复制事件甚至是突变的基因组进化。

测序技术大战生态危机

         

生态系统形成于长期的演化,系统中的物种经过成百上千年的竞争、排斥、适应和互利互助才形成了现在相互依赖又互相制约的密切关系。一个外来物种被引入后,可能因不能适应新环境而被排斥在系统之外;也可能因新的环境中没有相抗衡或制约它的生物加上其旺盛的繁殖力和强大的竞争力而改变或破坏当地的生态环境,甚至对人类安全和经济发展造成危害。

面对外来入侵物种触发的环境警报,人们也对其采取了一定措施:例如人工防治、化学防治及生物防治等多种手段。这些方法虽然可在一定程度上控制其蔓延趋势,但是很难从根本上逆转生物入侵造成的后果。因此,科研工作者开始致力于解析入侵物种的遗传密码,期望找到其环境适应性的基因组学基础,为入侵物种带来的生态危机寻找新的突破口。

随着高通量测序技术的快速发展及测序成本的持续下降,入侵物种基因组研究已逐渐打开新的局面,如美洲大蠊和大理石纹螯虾基因组均于今年发表在Nature子刊,近期又有蔗蟾及福寿螺基因组陆续发表。可见,入侵物种基因组研究已日渐受到研究者们的重视。

物种:美洲大蠊

拉丁名:Periplaneta americana

基因组大小:3.38 Gb

测序策略: Illumina

组装指标: Scaffolds N50=333kb

发表期刊:Nature Communications

发表时间:2018

美洲大蠊原产于非洲北部,在16世纪从非洲迁入美洲,并从此传遍世界各地,如今在中国各省市广泛分布。美洲大蠊食性复杂,适应能力极强;无需进行交配,就能通过孤雌生殖的方式进行繁殖,后代皆为雌性蟑螂,这些雌性蟑螂又能自己繁殖后代。研究者指出,一定数量的美洲大蠊在孤雌生殖的情况下,只要3年就能繁殖超过4代,足以对公共健康造成威胁,因为它们可作为病原体和室内过敏原的潜在载体。令科学家们恐惧的是,由于雌性蟑螂繁殖无需雄性,使得遏制蟑螂种群的问题变得棘手。

中科院植物生理生态研究所詹帅研究组与合作者对美洲大蠊进行了全基因组测序,组装得到3.38Gb美洲大蠊基因组,通过基因组及其功能分析对美洲大蠊的城市环境适应性和可塑性发育进行研究[1]。与其它昆虫比较发现,美洲大蠊扩张的基因家族主要与环境适应性有关,如化学感应和解毒,这些是美洲大蠊拥有广泛的环境适应性的基础。此外,研究人员也鉴定出了美洲大蠊参与发育和再生的信号传导路径。美洲大蠊有望作为一个模式物种被研究者用来开展蟑螂的生物学研究,基因组密码的破解将为防治美洲大蠊提供新思路。

物种:大理石纹螯虾

拉丁名:Procambarus virginalis

基因组大小:3.5 Gb

测序策略:Illumina

组装指标: Scaffolds N50=39.4 kb

发表期刊:Nature Ecology & Evolution

发表时间:2018

大理石纹螯虾(P. virginalis)作为一个热点物种,也是通过孤雌生殖的方式进行繁殖,令人惊奇的是,在大约25年前大理石纹螯虾还不存在。分子生物学家FrankLyko的团队对一只来自实验室的大理石纹螯虾进行基因组测序[2],基因组大小约3.5Gb,鉴定出21,000多个基因。更进一步的研究发现,大理石纹螯虾基因组的许多位点都有两种不同基因型,其中两条染色体序列几乎完全相同,但第三条却明显不同,两条染色体与P.fallax亲缘相近。

系统的野外实验和基因分型结果揭示了大理石纹螯虾在马达加斯加的快速扩张并确定其为淡水系统强有力的入侵物种。为了更好地了解该物种的传播规律,Lyko团队又测序了四只P.virginalis,测序结果显示P.virginalis的遗传多样性严重匮乏,事实上,所有P.virginalis似乎都起源于1995年德国发现的那只雌性大理石纹螯虾。

大理石纹螯虾具有独立的遗传变异,这一特性被认为是其在不同生境快速入侵的决定性因素,如随机表观遗传变异和/或表观遗传可塑性在大理石纹螯虾的快速适应性中发挥了重要作用。

物种:海蟾蜍

拉丁名:Rhinella marina

基因组大小:2.55Gb

测序策略:PacBio RSII+Illumina

组装指标: Scaffolds N50=168 kb

发表期刊:GigaScience

发表时间:2018

海蟾蜍(R. marina)原产于中美洲和南美洲,现已被引进世界很多其它地方,因它们的快速适应能力和对入侵地区土著动物的毒性而闻名。1935年,海蟾蜍被引进澳大利亚,释放到昆士兰州北部的甘蔗种植园内,用来控制甘蔗甲虫的危害(因此也被称为甘蔗蟾蜍)。而如今,澳大利亚海蟾蜍的数量已经超过了1亿只。海蟾蜍的毒性非常大,对于大多数动物来说,如果吞吃了它们的卵、蝌蚪或者成体,会立刻引起心力衰竭而死亡,这使得这种生物在澳大利亚境内几乎立于不败之地。此外,它还导致以本地蛙类为食的袋鼬已经有濒临灭绝的危险。

澳大利亚科学家WhiteP.等分析了海蟾蜍基因组[3],基因组大小为2.55Gb,重复序列占63.9%,是蟾蜍科首个报道的基因组。对组装序列进行BUSCO评估,在海蟾蜍基因组中可以找到90.6%的完整基因元件,说明绝大部分保守基因组装得比较完整,从侧面反映组装结果可信度较高。进一步对基因组进行注释,得到25,846个编码基因,与SwissProt数据库已知蛋白相似。

海蟾蜍基因组的解码为进一步认识无尾目动物的生物学遗传特性和入侵物种的进化奠定基础。更重要的是,这些数据将能够促进生物防控策略的创新和应用,从而减少海蟾蜍对本地物种的侵害。

物种:福寿螺

拉丁名:Pomacea canaliculata

基因组大小:440.1 Mb

测序策略:PacBio + Hi-C

组装指标: Contig N50=1.1 Mb

发表期刊:GigaScience

发表时间:2018

福寿螺(P. canaliculata)是一种淡水蜗牛,原产于南美亚马逊河流域,被列为全球100种最具威胁的外来物种之一,可造成农业生态系统的破坏和其它水生物种的灭绝。它的繁殖能力极强,生长速度快,耐受性强,对环境具有很强的适应性。

中国科学家通过Hi-C技术辅助PacBio组装得到福寿螺染色体级别的高质量基因组[4],基因组大小约440Mb,重复序列占11.4%,共鉴定21,533个基因。该研究主要发现了DNA/hAT-Charlie转座子的近代扩张、P450基因家族的扩张,以及细胞内稳态系统的组成,在胁迫环境的生态适应性中发挥重要作用。此外,卵巢和蛋白腺中卵黄蛋白周围基因的高水平转录促进了卵细胞营养供应和防御能力的提高。研究者还对福寿螺肠道进行宏基因组研究,发现许多用于食物消化和异生物降解的基因。这些研究成果为进一步研究福寿螺的生态适应性和高入侵能力的分子机制提供了新的视角。

除了以上物种之外,很多入侵植物也对当地的生态环境造成了严重影响:例如在我国云南地区疯长蔓延的紫茎泽兰、在南方地区河流水域大面积覆盖的凤眼莲、空心莲子草等……但关于入侵植物基因组的研究目前仍是一片空白。

物种:紫茎泽兰

拉丁名:Eupatorium coelestinum L

基因组信息:——

紫茎泽兰原产于中美洲,大约20世纪40年代紫茎泽兰由中缅边境传入云南南部,1935年在云南南部首次发现,随河谷、公路、铁路自南向北传播,时至今日,已覆盖云南80%的土地,并且大约以每年10-30公里的速度向北和向东扩散,目前已被列入我国首批外来入侵物种的第一位。紫茎泽兰是农、林、牧生产的大敌,其侵入农田、草地后与农作物、牧草竞争土壤养分和空间,严重影响农作物、牧草的生长。

物种: 凤眼莲

拉丁名:Eichhornia crassipes

基因组信息:——

凤眼莲又称水浮莲、水葫芦,原产于南美洲,1901年,凤眼莲作为一种观赏植物被引入我国,后作为猪饲料被推广种植。其根系发达,适应性强,在生长适宜区,常由于过度繁殖而抢占水面,致使大量水生生物因缺氧和阳光不足而死亡,破坏水中生态平衡。

物种:空心莲子草

拉丁名:Alternanthera philoxeroides

基因组信息:——

参考文献

[1] Li S,Zhu S, Jia Q, et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach[J]. Nature Communications,2018, 9(1).

[2]Gutekunst J, Andriantsoa R, Falckenhayn C, et al. Clonal genome evolution and rapid invasive spread of the marbled crayfish [J]. Nature Ecology &Evolution, 2018, 2(3):567.

[3]Richard J Edwards, et al. Draft genome assembly of the invasive cane toad, Rhinella marina [J]. GigaScience, 2018.

[4]Conghui Liu, et al. The genome of the golden apple snail Pomacea canaliculata provides insight into stress tolerance and invasive adaptation [J].GigaScience. 2018.

热烈祝贺第十九届全国植物基因组学大会圆满落幕

成都,八月,火热的季节,一场学术界的盛会在万众期盼中拉开帷幕,又在热烈的掌声中迎来尾声——2018年8月22日,由中国遗传学会植物遗传与基因组学专业委员会主办,四川农业大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所承办、武汉未来组参与赞助的第十九届全国植物基因组学大会圆满闭幕,会议历时3天,涵盖了最新植物功能基因组、蛋白组学、代谢组学、表观基因组及转基因组等技术最新进展,会议吸引了众多来自国内外植物基因组学领域有突出贡献的专家与学者,大牛云集,盛况空前。

会议现场,未来组向与会专家和学者展示了最新的三代测序技术研发及应用成果。未来组在多种复杂植物基因组测序组装中的项目经验不断吸引研究学者驻足咨询,咨询物种小到微藻,大到复杂的林木类,咨询内容从最初的样品采集及DNA提取,到项目中的生信分析细节,未来组的工作人员都进行了全方位的解答,获得了与会老师对未来组的认可。

 

与会老师和未来组工作人员亲切交谈

植物基因组比动物基因组复杂得多,其基因组普遍存在多倍性、高重复、高杂合等特点,是植物基因组测序组装的主要难点。武汉未来组基于三代测序平台(PacBio和Nanopore)、BioNano光学图谱和Hi-C染色体构象捕获技术,克服植物基因组中高杂合高重复的难点,已完成多种植物基因组及转录组测序项目,如木棉、杜仲、水稻、棉花、矮牵牛、玉米等,合作研究成果已有多篇发表于国际知名学术期刊。

续航i5K计划-探索节肢动物多样性基因组基础

i5K最初在2011年的科学杂志和美国昆虫学会上提出,是一项测序5000种节肢动物基因组的计划,目的是为节肢动物在分子水平上的研究提供基础参考。近日,美国印第安纳大学、德国明斯特大学等49家国际科研单位在bioRxiv预印网站上联合发表题为《The Genomic Basis ofArthropod Diversity》的文章,从基因组角度揭示节肢动物多样性的基础[1],为I5K计划新添浓墨重彩的一笔。节肢动物多样性居动物界首位,在生态系统中发挥着重要作用,但在分子水平上却仍具有很高的保守性。详细解析节肢动物超多样性分类群的基因组序列变化能够帮助我们更深入的探究其基因组进化的问题。

研究者选取了76种节肢动物的全基因组序列,代表了跨越约5亿年节肢动物进化史的21个目。通过全基因组序列分析,研究比较并解释了基因和蛋白结构域的变化,鉴定了许多在节肢动物进化早期和分化成为当下昆虫阶元过程中出现的新基因家族,还揭示了节肢动物DNA甲基化模式的转变,并发现了基因家族和蛋白结构域进化与表型和生理适应性同步出现的例证。这些分析表明大规模比较基因组学研究可以为基因型到表型的映射提供新见解,并且可以进一步提出关于动物多样性进化的可检验假说。

研究材料

为响应i5K试点项目,研究者挑选了28个节肢动物进行基因组测序注释,包括农业和生态学研究的重要物种、实验室模式物种和节肢动物系统发育中关键节点的物种等。另外,对含48种已测序节肢动物共76个物种进行研究,涉及现存节肢动物的4个亚门中的21个目。

研究结果

选取76种节肢动物结合3个外群,采用OrthoDB基因同源数据库从76个物种中共注释了38,195个同源蛋白质组(orthologous proteins groups),28种i5K试点项目测序的物种共注释了533,636个基因模型(gene models),如Fig.1所示。

Fig.1 i5K试点项目76个物种OrthoDB同源性分析

研究者基于目阶元的单拷贝同源基因组,构建了所有主要节肢动物家系的系统发育树(Fig.2)。除了甲壳类我们认为是单系发育而之前认为是六足类复系之外,大部分与前期已报道的节肢动物发育树相一致。该研究对76种节肢动物每个家系的38,195个同源蛋白质组进行基因和蛋白域重构,用于后续分析。

Fig.2节肢动物系统发育树

研究者进一步根据系统发育树对基因家族进行扩张和收缩分析,发现有181,157个基因家族扩张,87,505个基因家族收缩。68,430个基因家族至少在一个家系中消失,其中,9,115个家族出现在不同群体中。变化最大的几个基因家族编码蛋白涉及的主要功能有抵御外来生物(细胞色素P450s,磺基转移酶)、消化(肽酶)、几丁质骨架结构和代谢、多锌指转录因子类型、HSP20域胁迫响应、脂肪酸代谢和蜕化类固醇代谢等。

根据系统发育树还可推测祖先节肢动物的特点。如在最近的昆虫祖先(LICA)中共鉴定9,061个基因,147个基因家族,且有些家族在昆虫发育和适应性进化中发挥重要作用,而在完全变态昆虫进化过程中只鉴定到10个基因家族,表明在过渡的过程中许多基因家族已经存在(Fig.3A、B)。基因家族的变化可能是某一特殊表型过渡的基础。

Fig.3 基因家族,蛋白域和甲基化分析

在昆虫特定的目中,研究者还发现了大量的基因,引人注目的是,在鳞翅目节点处有1038个基因家族,是所有家系节点中基因家族最多的(Fig.3C)。

结果还发现,种特异性基因家族扩张受自然选择的影响,如切叶蚁,在世界各地人类住房中随处可见,在节肢动物中快速进化的基因家族数最高,同时,还发现其基因扩增和丢失以及蛋白结构域重排比率也是最高的(Fig.3D、E)。

研究者对不同节肢动物之间DNA甲基化水平进行了研究,结果发现,半变态昆虫和非昆虫的节肢动物DNA甲基化水平要高于全变态昆虫。对所有蜘蛛类和树皮蝎子基因组甲基化就行分析,发现蜘蛛类甲基化比率很高,显现出明显的双峰(Fig.3F)。

Fig.4 节肢动物基因组变化速率

有趣的是,研究结果发现基因扩增和缺失比率与结构域重排间有着很强的关联,而氨基酸替换率变化与基因扩增和缺失比率没有关联(Fig.4)。

i5K计划已组装出前无古人的节肢动物基因组数据集,并已在农作物、森林虫害等方面建功卓著,而该研究则全面分析了跨越5亿年节肢动物门的基因组,发现主要的形态转变不能归因于基因组某一特定改变,而是关联一系列复杂的基因网络。要更好的理解基因型和表型之间的映射关系需要更深入的研究来验证基因组学的假设,而多样性丰富的节肢动物正为表型研究提供了无可比拟的材料,结合易处理的实验属性,该领域的研究将来还有极其广阔的前景。多样性基因组研究将促使节肢动物以往的类群划分,概念定义乃至整个系统演化脉络都发生深刻的变化。

武汉未来组凭借自身拥有的PacBio Sequel、GrindION、PromethION、BioNano光学图谱、HiC染色体构象捕获技术和平台,以及丰富的基因组学经验,推出了“TOP1000昆虫基因组计划”、“个人参考基因组服务计划”、 “华夏万人结构变异计划”等。在承诺高标准交付指标的同时,未来组将进一步大幅压缩项目服务周期,为合作伙伴提供专业优质的服务。

参考文献

Thomas, G.W.C., et al., The Genomic Basis of Arthropod Diversity. bioRxiv, 2018. http://dx.doi.org/10.1101/382945.

LAI——基因组质量评估新标准

近日,来自美国密西根州立大学的区树俊博士等人在《Nucleic Acids Research》上发表了一篇名为《Assessing genome assembly quality using the LTR Assembly Index (LAI) 》的论文,提出了一种无需用参考基因组衡量组装连续性的方法——长末端重复序列组装指数(LTR Assembly Index,LAI)。该研究阐明LAI独立于基因组大小、LTR-RT含量以及基因空间评估指标(如BUSCO和CEGMA)等参数,还发现使用长读长技术比短读长技术能获得更好的组装连续性。而且,LAI能够通过选择组装软件促进迭代组装的优化并鉴定低质量的基因组区域。为了更好的应用LAI,基因组中完整的LTR-RTs应至少占0.1%而全部的LTR-RTs至少占5%。目前LAI程序免费在GitHub上开放(https://github.com/oushujun/LTR_retriever)。

LTR(Long terminal repeat)是存在于LTR反转录转座子(LTR-RTs)两侧翼的长末端重复序列,而LTR-RTs是散在的重复元件,通常在4-20Kb左右,是植物基因组中主要的反转录转座子成分。转座元件(TEs)由于组装难度大,迄今都没有针对重复序列建立起可靠的评估标准。Contig N50、BUSCO和CEGMA等评估方式或多或少受到人为、有无参考基因组等因素的影响。

研究者发现使用PacBio长读长测序技术比第二代测序技术组装的玉米参考基因组中能找到更多的完整LTR 元件,还有研究发现对于海枣的LTR-RTs,短读长测序只能覆盖其中的小片段,因此需要更连续的基因组来鉴定更完整的LTR元件,而LTR_retriever软件可准确鉴定完整LTR-RTs,消除假阳性LTR且灵敏度超高、错误率极低——通过鉴定完整LTR元件数量来指示基因间的重复序列组装质量切实可行。

材料

本研究搜集了103个全基因组序列,均含至少5%的LTR-RTs以保证LAI评估准确性;高质量长读长基因组标准为contig N50>100Kb且BUSCO和CEGMA评估完整度>80%或者任一评估>90%。若基因组来自不同测序平台,则以构建contig的主要平台技术为准。又从核苷酸数据库收集21种植物共14,826个高质量BAC序列,筛选标准是标题注明“完整序列”且序列≥20Kb;少于10个gaps的BACs草图若序列片段≥20Kb也予以保留。BAC序列的相同片段聚在一起作为一个样本,若<3Mb或含少于5%的LTR序列则不用于分析。

方法

原始LAI计算方式如下:

本研究使用LTR_retriever鉴定完整LTR-RTs,为鉴定出基因组中所有的LTR序列,逐渐递增同源关系搜索的分化阈值,并使用LTR一致性(LTR identity)来反映LTR-RTs动态。

LAI计算步骤:

(1)  获取候选LTR-RTs

(2)  过滤错误候选结果、保留所有完整LTR-RTs

(3)  全基因组LTR-RT注释

(4)  计算LAI

在本研究中,使用LTRharvest获取候选LTR-RTs,并用RepeatMasker注释。在评估原始LAI后生成全基因组原始LAI分值,并计算LTRs的平均一致性。当全部LTR-RT在全基因组和区域的LTR-RT都少于1%时,将区域的LAI降低到原分值的10%以抑制LAI分值过高。

修正LAI计算方式:

LAI = raw LAI + 2.8138 × (94 – whole genome LTR identity),文中提到的LAI均为修正LAI。

结果

构建LAI

为检测原始LAI和LTR-RTs动态之间的关系,研究分析了20个使用长读长测序、组装质量较高的植物基因组,结果显示原始LAI的分值和这些高质量基因组的平均LTR一致性呈线性相关。通过LTR-RT的消除(r2=0.15,P=0.10)发现校正后的LAI和solo LTR含量之间没有明显关联。这些数据表明使用全基因组LTR一致性校正原始LAI行之有效(见Fig. 1A、B、C、D)。

Fig. 1 20个高质量植物基因组LAI的特性和校正

LAI特征

研究通过LAI和其他常用基因组评估方式对高质量基因组进行分析,结果表明LAI和这些基因组中完整LTR-RTs含量呈线性关系(r2= 0.45, P = 0.001) 。另外,LAI和全LTR-RTs含量(r2=0.17,P=0.07)、单倍体基因组大小(r2=0.09,P=0.21)、全scaffold大小(r2=0.14,P=0.11)、CEGMA完整度(r2=0.04,P=0.39)、BUSCO完整度(r2=0.04,P=0.37)以及contig N50(r2=0.03,P=0.49)等没有显著关联(Fig. 1E、F、G、H、I),表明LAI作为一种新的基因组评估方式和现有的基因组评估方式之间是独立的。总之,LAI在不同植物基因组大小、全LTR-RT含量和LTR-RT动态等方面都展现出较强的鲁棒性,反映了其在比较不同植物基因组组装质量上的潜能。

为了进一步检测LAI的特征,研究又分析了44个不同质量的植物基因组。和高质量组装基因组中的发现相似,LAI和全LTR-RT含量(r2=0.06,P=0.10)以及基因组大小(r2=0.0004,P=0.89)之间不相关,而与完整LTR-RT含量线性相关,和contig N50和scaffold N50相关性极低。

值得一提的是,BUSCO和CEGMA完整度无法很好的预估LAI的结果(r2≤0.06,P≥0.12),表明LAI呈现出的序列特性和基因空间的特性有差异;相反,CEGMA和BUSCO之间的结果较为一致。上述结果再次从侧面反映了LAI是一种全新的基因组评估方式(Fig. 2)。

Fig. 2 对不同组装质量基因组之间LAI和其他基因组评估方式的关系

用LAI比较测序技术

为了比较新测序技术和测序界的金标准——BAC测序技术的组装连续性,研究者分析了21种植物共14,826个高质量BAC序列和使用不同测序技术获得的70种植物全基因组序列。

结果发现高质量BAC序列LAI分值是所有测序技术中最高之一,平均分值为15.5,而以Illumina和Roche454等为代表的第二代测序虽大大降低了测序成本,但是其在解决重复序列上的能力却十分有限——主要以短reads组装的结果LAI分值都低于10,低于其他所有测序技术。Sanger全基因组鸟枪法测序(WGS)即使覆盖深度低至69×也还是获取了高质量的基因组,平均LAI达14.4,但因成本高、效益低等缺点导致构建高深度的BAC文库和补洞都非常困难。

近年,单分子长读长测序技术在基因组测序领域逐渐兴起。无GC偏向性的PacBio测序技术和超长读长的nanopore测序技术使获取高分辨率的复杂序列结构成为可能。研究发现,使用长读长组装的基因组获得的基因间的重复序列在各种不同的测序技术中是组装得最好的。虽然Sanger WGS基因组和长读长基因组的LAI分值没有统计学上的差异,但是显然使用长读长测序技术能够获取更高质量的基因组。例如,24个长读长基因组中的19个获得了高于10的LAI分值(79%),而18个Sanger WGS中高于10分的为12个(67%)(Fig. 3)。

Fig. 3 不同测序技术获得基因组的LAI分值比较

低质量基因组区的鉴定

上述结果表明,LAI与LTR-RT含量及基因组大小无关,因此,通过对LAI的精确估计,该方法可以使基因组组装质量实现可视化。为此,研究者以300Kb增量的3 Mb-sliding windows为基础,计算了基因组组装的LAI分值。结果表明,由PacBio长读长测序的玉米参考基因组(B73 V4)在整个程序集中平均分布有很高的LAI分值(Fig.4C)。在3号染色体区域玉米三个版本的参考基因组的LAI分数的比较,显示了组装质量的连续提高(Fig.4D)。

Fig.4 LAI分值反映重复序列区域的组装质量。A.水稻(Nipponbare MSU v7);B.水稻(Kasalath);C.玉米(B73v4);D.玉米B73基因组的三个版本。

LAI评估促进基因组组装优化

为了评估基因组测序和组装技术是否随着时间推移有所进步,研究者计算并比较了模式植物基因组的多个组装版本的LAI分值。结果表明,基于Sanger测序和基于BAC进行scaffolding组装的基因组具有较高的LAI评分,而基于NGS测序的基因组的LAI评分最低,这反映了二代测序技术在组装基因组重复序列及提升序列连续性等方面的劣势。相比之下,长读长测序技术大大提升了基因组的组装质量,显示了三代测序技术在基因组测序组装领域的巨大前景(Fig. 5)。同时,研究者利用LAI评估基于同一批Oxford Nanopore测序数据组装的四个不同版本的野生番茄基因组,比较各个组装策略的优劣性(Fig. 5D)。结果显示,基于Canu-SMARTdenovo方法组装的野生番茄基因组具有更高的连续性和完整性。

Fig.5 模式植物基因组的LTR组装指标

总结

鉴于LTR-RT序列是当下测序技术和组装算法的一大挑战,其组装质量可以反映出全基因组的组装质量。本研究开发的LAI解决了两个问题:①影响完整LTR-RTs在基因组间变化的因素如全LTR-RT含量(含完整LTR-RTs和片段化的LTR-RTs)等的可控化;②LTR-RTs的活性包括LTR-RTs的扩增和消除的可控化,两个因素使得LAI可以用来对不同物种基因组的连续性进行比较。分析证明LAI是可评估基因间重复序列的通用方式,基于此该研究提出了基于LAI分值的组装分类标准(Table 1)。

Table 1. 基于LAI的重复序列组装分类

BAC测序作为真核生物基因组测序的金标准,仍然存在很多gaps、组装错误并丢失大量序列。而长读长测序技术能跨越富含嵌套转座子插入和高度一致的重复序列,和其他测序技术相比能够得到较高的LAI分值,即获得更高的组装指标。

使用LAI,研究者可以评估基因组组装的质量、比较不同基因组版本的组装质量、选择最好的组装软件,并且首次实现不同物种之间基因间重复序列组装连续性的比较。随着测序技术和组装算法的不断发展,基因组测序正在从以测序本身作为焦点逐渐转变为以回答生物学问题为核心,LAI也因之成为基因组组装质量检验的重要手段。