Nanopore混测1cell，一次性解决12个细菌完成图，送质粒

从三代PacBio长读长测序应用全面市场化后，在基因组学领域从量变突破到质变的一个应用，非细菌基因组完成图莫属。随着平台机型从RS→RSⅡ→Sequel的更新换代以及试剂版本的升级，使得测序数据的读长和通量不断上升，让细菌完成图产品不断成熟完善，价格也早已跌破万元，奠定了PacBio在单菌基因组完成图领域的不二选择。

如果想要一次性测很多个菌怎么办？

2017年9月在 Microbial Genomics 发表的一篇将纳米孔测序技术（Oxford Nanopore）应用到细菌混测的实例中，解决了之前基于二代Illumina测细菌基因组结果中充斥着gaps、N碱基，成不了完成图的问题。

该研究在一个flowcell中混测了12个不同种的克雷伯氏肺炎菌，与前期二代数据混合组装，既保证完整性，又保证base准确性，最终将它们都组装成了完成图，并且有7个样本组装出了所有的质粒（其它5个样本组装出部分质粒）。

该研究中价格比较：

Illumina：80 USD /sample

ONT：950 USD/ 12 Samples

实验流程

1.DNA 提取

2.12个样本分别加barcode（native barcoding expansion kit (EXP-NBD103)）

3.12个样本等量混合

4.加测序接头，按照1D模式建库（1D ligation sequencing kit (SQK-LSK108)）

5.Nanopore MinION上机1个flowcell（R9.4）

实验结果

>>>>数据评估

base calling后，共产出10.48 Gb ONT 数据，经过拆分barcode后，获得6.87 Gb数据用于组装，拆分率约为65.5%。

去掉接头和barcode序列后，reads N50为22.9Kb，长读长测序有助于提高组装的连续性。

测序数据在12个菌种间分布并不算均匀，覆盖深度从16×到308×（Fig.1），可能是因为混测个数过多以及barcode拆分效率等导致。

>>>>组装评估

使用Unicycler对ONT数据和Illumina数据进行混合组装，将12个样本都组装成完成图，并且其中7个样本中所有的质粒同时被组装完整。

Figure Illumina单独组装和ONT、Illumina混合组装12个克雷伯氏菌圈图及质粒对比

本方法1个ONT flowcell混了12个细菌，结合二代数据混合组装，全部获得基因组完成图，经济适用并高效。

这种加barcode混测的策略，只能针对可分离培养的菌种。

参考文献

WICK, Ryan R., et al. Completing bacterial genome assemblies with multiplex MinION sequencing. Microbial genomics, 2017,3.10.

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