利用PacBio三代测序技术获得模式植物拟南芥的全基因组6mA修饰图谱

未来组项目经验

2018年4月，未来组携手中国农业科学院生物技术研究所谷晓峰研究组和新加坡国立大学生物系及淡马锡生命科学研究所俞皓研究组合作在Developmental Cell杂志发表了题为“DNA N6-Adenine Methylation in Arabidopsis thaliana”的研究论文，利用PacBio三代测序技术获得模式植物拟南芥的全基因组6mA修饰图谱，解析其分布模式和潜在功能。

研究概述

研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平，后续选择D9和D21的样本进行三代PacBio SMRT全基因组测序，比较两个时期拟南芥6mA修饰的分布模型和动态变化，并结合转录组信息更深入地研究6mA潜在功能。

Highlights

• 6mA修饰在拟南芥基因组内广泛存在
• 与基因间区相比，6mA在 gene body区更丰富
• 在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态的
• 6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联

研究结果

6mA修饰在拟南芥基因组内广泛存在

研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平，发现在这些样本中都广泛存在不同程度的6mA，其水平随着个体发育的进程逐渐增加，在D21出现了急剧上升。

Fig.1Dot blot方法检测拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平

使用PacBio SMRT测序获得拟南芥全基因组6mA图谱

Fig.2 链特异性的6mA修饰信息

以D9样本示例，PacBio SMRT测序深度经计算为103×，高于PB官方推荐的测全基因组甲基化的要求100×。通过测序时两个脉冲荧光信号之间的间隔时间评估该位点的甲基化程度（Fig.2），最终获得了链特异性的D9全基因组6mA信息(Fig.3A)。实验结果表明，在包含线粒体、叶绿体和核基因组中所有的29,811个腺嘌呤中，发生6mA碱基修饰的比例为0.04%，与LC-MS/MS实验中评估的0.048%吻合，并且发现在越靠近着丝粒区域表现出越高的6mA丰度和轻微降低的平均甲基化水平（Fig.4）。

Fig.3D9 (A)和D21 (B) 拟南芥全基因组6mA图谱

Fig.4 6mA丰度和水平在染色体臂上的分布情况

6mA分布模式解析

通过评估6mA在基因组内不同的区域（Exon、Intron、5’UTR、3’UTR区，Fig.5A）和位处基因的不同类型（Protein coding、miRNA、snoRNA等，Fig.5 B、C）分析6mA的分布模型得知：与基因间区相比，6mA在 gene body区更丰富（Table 1）。

Fig.5 6mA分布模式解析(D9)

在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态的

通过比较D9和D21拟南芥全基因组6mA分布图谱（Fig.3）、overlap关系（Fig.6）、分布模式的区别（Fig.5、7），可以得知在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态变化的，在位点、程度上都有明显的区别。

Fig.6 D9和D21拟南芥基因组中6mA分布比较韦恩图

Fig.7 6mA分布模式解析(D21)

Fig.8示例了2个基因在D9和D21两个发育阶段不同的6mA修饰位点。D21比D9拥有更多的6mA修饰位点。也支持了在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态变化的。

Fig.8 2个基因在D9和D21两个发育阶段不同的6mA修饰位点示例

6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联

通过将6mA修饰位点及程度与来自RNA-seq的基因表达信息结合分析，结果表明6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联。

高表达基因的TSS上下游2.5kb区域内有更多的6mA修饰位点（Fig.9 A、B）,高表达的基因有更多的6mA修饰位点（Fig.9 C、D）,被6mA修饰的基因比未修饰的基因表达水平显著增高（Fig.9 E、F），并且靠近TSS时，差异更明显。

Fig.9 6mA修饰与RNA数据关联分析

这篇论文是国内发表的首篇基于PacBio单分子测序技术进行真核生物6mA修饰分析的研究成果，揭示了拟南芥中6mA修饰的发生规律，并为研究陆生植物碱基修饰的分布模式和潜在功能提供基础。武汉未来组凭借丰富的三代测序项目经验在为该项目提供PacBio测序服务并参与分析。

其它真核生物6mA研究高分文章（三代测序直读）：

线虫

6mA甲基化对跨代遗传的影响

Greer, E.L. et al. DNA methylation on N6-adenine in C. elegans. Cell 161, 868–878 (2015).

小鼠

6mA在哺乳动物中可影响基因沉默

Wu, T.P. et al. DNA methylation on N(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature 532, 329–333 (2016).

真菌

从多种真菌三代基因组测序数据中挖掘甲基化信息

Mondo, S.J. et al. Widespread adenine N6-methylation of active genes in fungi. Nature Genetics (2017).

延伸阅读

NanoMod 发布，适配于纳米孔测序数据的碱基修饰检测工具

参考文献

Liang et al., DNA N6-Adenine Methylationin Arabidopsis thaliana, Developmental Cell (2018)

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