Nature丨“六角恐龙”-美西钝口螈基因组（32Gb）

1月24日，Nature在线发表美西钝口螈（Ambystoma mexicanum）（~32Gb）基因组组装结果，是迄今组装完成最大的基因组。文章中开发了新算法MARVEL，实现了对超大基因组低深度三代测序数据的组装。基因组信息显示，内含子和基因间区的极大扩张助于形成如此规模的基因组。美西钝口螈基因组中不包含其它已知脊椎动物基本的发育基因Pax3，其基因功能由旁系同源基因Pax7 代偿。

Fig.1美西钝口螈（Ambystoma mexicanum）

研究结果

1. 基因组组装

基因组组装流程（Fig.2A）：32×PacBio SMRT测序+Bionano光学图谱+MARVEL新算法。MARVEL新算法集成两阶段reads校正程序，可以保持长reads的完整性。组装Congtig N50：216kb，Scaffold N50：3Mb，基因组大小：32.4Gb。基因组中重复序列占65.6%（18.6Gb），说明如果能在长区段重复序列有很好的覆盖和跨越，对基因组组装起至关重要的作用。本文中使用的PacBio和近期火热的Oxford Nanopore并称三代单分子长读长测序，能更好地覆盖长重复序列区域（示例，Fig.2B），有助于复杂基因组组装。

Fig. 2 A基因组组装流程

B 长读长测序有助于覆盖长重复序列示例

2. 长末端重复逆转录因子扩张

美西钝口螈基因组中重复序列高达18.6Gb，其中LTR和LINE是最主要的类别（Fig.3），其中不少长度超过10kb，并且组装出的97%的contigs都以LTR元件结尾。

Fig.3 A重复元件类型分析

B 通过GyDB2.0对重复序列注释并构树

通过重复元件的相对形成时间分析得知：美西钝口螈基因组经历了持续时间很长的转座子活跃期，随后发生了近期持续性爆发式的重复序列扩张（Fig.4），大规模的重复序列扩张让美西钝口螈拥有如此庞大的基因组。

Fig.4 Relative age (Kimura distance)

3. HoxA 基因簇和受限的内含子大小

HoxA基因在肢体的近远轴（proximal-to-distal）发育中发挥重要作用，并且在断肢再生过程中会被重新活化。本研究中美西钝口螈的HoxA基因位点在单个contig上，含有明显的重复区域，比人类和蛙类的该基因大3.5倍，可能是由于该基因簇中在HoxA3和HoxA4之间存在一段170kb的扩张。

Fig.5 HoxA 基因簇的基因和重复元件比较分析
（人类、蛙类、美西钝口螈）

研究人员还比较分析了人类、小鼠、蛙类和美西钝口螈之间大量同源基因的内含子大小，结果发现(Fig.6)：美西钝口螈中非发育基因平均大小是其它物种的13-25倍，而发育基因的内含子扩张倍数相比较低（6-11倍）；并且与人类、小鼠和蛙类相反，美西钝口螈中发育基因的内含子比非发育基因的内含子要短。多种证据显示美西钝口螈中与发育相关的基因限制了自身内含子大小，原因可能是：在某些特殊的发育期，更小的基因大小有助于迅速地转录，从而上调基因表达。

Fig.6 人类、小鼠、蛙类和美西钝口螈之间的
发育基因和非发育基因中的内含子长度比较

4. 某些Pax家族成员缺失

通过基因注释和基因家族分析，在美西钝口螈中鉴定出了Pax4 缺失（其它两栖动物和脊椎动物也缺失Pax4），和Pax3 缺失（然而所有其它已知的脊椎动物都含有Pax3）。为了进一步验证美西钝口螈中Pax3 的缺失，研究人员1). 在基因组测序以及转录组测序的原始数据未发现Pax3的序列，2). 检查了Pax3 基因区域的邻近基因和高保守非外显子元件（non-exonic elements, CNEs)，发现在小鼠的Pax3 附近的基因Sgpp2、Epha4以及CNEs也同样存在于美西钝口螈中，但未找到Pax3 或者任何与Pax3 相关的CNEs(Fig.7)。这些证据说明，美西钝口螈丢失了Pax3 及与之相关的顺式作用元件。

Fig.7 美西钝口螈中，四足动物Pax7 和Pax3位点的保守基因和CNEs分析

5. Pax7功能研究

在其它脊椎动物中，Pax3 和Pax7 都对肌肉、神经管和神经鞘等组织的发育起重要作用，尽管它们有一部分功能类似，但两者中任何一个的缺失都会导致很明显的表型变化（小鼠）。然而美西钝口螈缺失了其它四足动物都有的Pax3 基因后，由Pax7 承担起了类似的基因功能。为了更深入地研究美西钝口螈中Pax7的功能，研究人员利用TALEN和CRISPR-mediated基因编辑，形成不同的Pax7突变（Fig.8 a）。在子代中进行表型分析（Fig.8b-h）并以PCR和蛋白检验做验证。

本研究中的结果总的来说是：美西钝口螈中Pax7 基因的变异带来的表型变化，是其它脊椎动物中Pax3- 和Pax7- 突变表型的合集。后续可以进一步分析Pax7 基因在美西钝口螈中是如何调节，使得其绕过了Pax3 基因的丢失在其它脊椎动物中带来的发育影响。

Fig.8美西钝口螈Pax7 突变体与小鼠Pax3−/−Pax7−/−突变体有类似的表型

蝾螈的断肢再生功能具有非常重要的临床研究意义，此次美西钝口螈基因组的完成，与以往的单纯转录组数据相比，为研究提供了更为完整的参考信息。

参考文献

Sergej Nowoshilow, Siegfried Schloissnig, Ji-Feng Fei , et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.Nature.2018

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