王凯组发布新算法RepeatHMM，剑指DNA重复类“暗物质”诱发遗传病

微卫星序列扩张，尤其是三核苷酸重复扩张，会引起脆性X综合征，弗里德赖希运动失调，肌强直性营养不良和脆性XE神经缺陷等40多种遗传性疾病，这些统称为三核苷酸重复性疾病TRDs。

如，ATXN3基因通常含有13-41个CAG重复，而ATXN3基因上CAG重复超过55个后具有致病性，会引起脊髓小脑性共济失调3型疾病SCA3。除此，不同的致病性CAG重复次数，会引起其他多种多聚谷氨酰胺疾病。

TRDs的严重性和TRDs综合征发作年龄与三核苷酸重复序列大小密切相关，重复单元数量超过一定阈值后，重复单元数量越高，疾病症状将更严重，综合征发作年龄将越提前，严重的会诱发遗传早现现象。因此，对三核苷酸的重复单元准确检测不仅将提高科研人员对TRDs及其中分子机制的理解，同时，对TRDs临床诊断，风险评估和预后都尤为重要。

微卫星序列重复单元检测方法

目前，在对微卫星序列重复次数检测的方法中，通常会先对基因组中靶序列进行PCR扩增，再经毛细管电泳等技术手段鉴定，但都费时费力，且通量低；Sanger测序又对长的重复序列很无奈；而二代测序读长太短，很难测通整个重复片段区域，当然还无法覆盖高GC含量区域。

第三代高通量测序技术，如PacBio SMRT测序和Oxford Nanopore测序，可覆盖10K及以上的序列，因为是单分子测序，对GC含量异常区域没有偏好性，可解决上述检测手段在重复片段区域的瓶颈。然而由于三代测序单reads的准确度有限，如PacBio的三代测序数据的单read的碱基错误率平均达到了15%，现有的算法并不能有效地检测出基于三代的长读长reads的微卫星序列重复单元。

重复单元鉴定新工具RepeatHMM

希望组&未来组创始人之一的王凯教授，带领实验室开发了一套基于三代测序的repeat region鉴定的算法RepeatHMM，解决了目前微卫星序列重复单元鉴定的技术瓶颈，该算法不仅能识别出repeat region，同时能够鉴别重复单元，进而计算出重复单元数量和重复片段的大小。这为更进一步认识基因组、鉴定因repeat region变化导致的遗传病等，奠定了算法基础。

RepeatHMM流程如Fig. 1，先找出目标区域的起始位置；然后对覆盖该区域的长reads进行切割mapping，以提高mapping的准确率；三是要保证重复区域上下游的一些特异性片段，作为标记mapping上；四是针对三代测序的错误进行纠正；五是基于隐马可夫模型进行重复片段估算；六是基于peak calling算法，进行位点的重复片段分布估算。

RepeatHMM获取地址：

https://github.com/WGLab/RepeatHMM

RepeatHMM评估方法

模拟数据1评估：

100套不同覆盖深度PacBio模拟数据，设置ATN1正常和致病性等位基因 CAG重复次数。

模拟数据2评估：

根据真实PCR扩增情况模拟100套不同覆盖深度的PCR扩增数据。

SCA3患者数据评估：

经PacBIo Sequel对25名参与者（20名SCA3患者，5名健康对照者）ATXN3基因的扩增子进行测序。

SCA10患者数据评估：

基于SCA10的3个患者原始数据，评估RepeatHMM在更为复杂重复类型的检测性能。

NA12878不同平台数据评估：

基于NA12878的三个平台（PacBio SMRT ~50X，Oxford Nanopore ~30X，Illumina ~300X）及正常表型HX1（PacBio SMRT , ~100X）。

RepeatHMM评估结果

1.结果显示RepeatHMM和 BAMself工具在覆盖度从10至50时，正常等位基因的RMSE（评估预估重复次数和真实重复次数间差异）降低， RepeatHMM和 BAMself工具在覆盖度从10到200时，致病性等位基因的RMSE降低，但是RepeatHMM的提升更加明显，覆盖度超过200时，RepeatHMM的致病性等位基因RMSE降低至2.0以下。与BAMself相比，在大多数正常等位基因和致病性等位基因中，RepeatHMM能得到更准确的重复次数（Figure 2a和c）。

2.基于PCR扩增的模拟数据与1的结果高度一致，但，对于致病性等位基因的RMSE如要和1在一个水平，则需要更高覆盖度的数据（Figure 2b和d）。

3.基于Sequel的SCA3原始数据，RepeatHMM的预测结果非常好，与毛细管电泳检测的重复次数基本0或1，而且与BAMself和TRhist相比，特别是在病原等位基因上，预测性更好。另外， RepeatCCS（基于CCS序列的RepeatHMM）虽预测性比BAMself 和TRhist要好，但其预测错误率比RepeatHMM高很多（Figure 3）。

4.SCA10数据评估，发现BAMself 和TRhist不能准确检出3个患者的ATXN3致病等位基因的重复单元数量，而RepeatHMM评估的重复大小更接近于凝胶电泳的预测结果（Table 1）。

5. NA12878不同平台数据评估显示，以Illumina数据为标准，两个长读长平台预测与Illumina预测高度一致，表明具不同数据错误类型的测序平台数据可在RepeatHMM上进行分析(Figure 5)

基于上述全方位的评估，从模拟数据到真实TRDs患者数据，从简单重复类型的SCA3患者数据到更为复杂重复类型的SCA10患者数据，再从不同测序平台进行评估，都显示出RepeatHMM的分析优势。

相对常规方法，RepeatHMM中HMM 对重复序列区域检测相当灵活，适用于不同重复单元类型，不同重复单元长度；其次，可将不同测序平台数据经不同参数整合到HMM中；再次，RepeatHMM运算非常高效，如在对1名患者的ATXN3的原始数据（~21,000X）分析时，通常需要2-12min。

希望组&未来组发布的分析新工具RepeatHMM，具使用灵活、高效等特征，结合长读长测序数据，将能对微卫星序列重复单元数量进行快速便捷的鉴定，可以广泛应用于微卫星重复性疾病的研究中。

作为三代测序精准医疗公司，希望组未来会将这款工具的应用延伸到临床诊断中，不断突破现有测序技术所面临的瓶颈和挑战，切实提高遗传病诊断准确度和检出率，降低出生缺陷和罕见病的发生率。

参考文献

Liu Q, Zhang P, Wang D, et al. Interrogating the “unsequenceable” genomic trinucleotide repeat disorders by long-read sequencing[J]. Genome Medicine,2017, 9:65.