未来组最新Paper：冬虫夏草线粒体基因组及DNA甲基化修饰信息

近日，由湖南农业大学研究团队完成，未来组参与的冬虫夏草线粒体基因组项目文章见刊Frontiers in Microbiology。研究经PacBio SMRT测序技术，解析了冬虫夏草线粒体基因组完成图，并构建肉座菌目真菌系统进化分析，为冬虫夏草的分类地位提供了遗传学证据，同时，对线粒体基因组范围的DNA甲基化修饰进行分析，为目前首篇研究真菌线粒体基因组表观修饰的论文报道。

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是冬虫夏草菌感染蝠蛾幼虫而形成的冬虫夏草菌子实体与僵虫菌核（幼虫尸体）构成的复合体，是中国传统名贵中药材，主要产于中国西藏高原等高寒地带和雪山草原。冬虫夏草线粒体基因组完成图的获得可对冬虫夏草的进化和系统分类进行深入分析，同时，在PacBio测序中，带有甲基化修饰的DNA碱基会出现荧光脉冲信号的延迟，可直接被识别检测到，因此从测序原始数据中直接获得冬虫夏草线粒体基因组的甲基化信息，也为肉座菌目真菌线粒体基因组的表观修饰的进一步研究提供参考。

研究方法

采集冬虫夏草子实体进行DNA提取；质检合格后，构建20kb文库，上机PacBio RS II测序，P6C4，8个SMRT cell；将过滤后数据与已公布的201个真菌线粒体基因组比对，提取属于线粒体的序列，经HGAP组装；后进行线粒体基因组注释、甲基化和进化分析。

研究结果

1. 经组装，得到成环的冬虫夏草线粒体基因组57,539bp，含有14 个保守蛋白编码基因（PCGs）， 1个rps3， 27个 tRNAs和 2个 rRNA，其中AT含量占69.8%。另外，冬虫夏草线粒体基因组中内含子54个，与肉座菌目其他真菌相比数量最多，分析还确定了73个ORFs（Figure 1 和Table 1）。

Figure 1冬虫夏草线粒体基因组圈图

Table 1 肉座菌目真菌线粒体基因组特征对比

2. 基于14个与OXPHOS系统相关的保守PCGs做ML系统进化树分析，分类结果确定了冬虫夏草在虫草科中的分类地位，再次更正了之前经冬虫夏草形态学分类到Cordycepssp. 的错误（Figure 2）。

Figure 2基于冬虫夏草线粒体基因组中14个PCGs ML系统进化树

3. 基于19个肉座菌目真菌rps3基因构建的进化关系，发现与上述基于PCGs的系统进化关系有差别，在对肉座菌目中rps3基因的选择压力分析中，加入了外群P. nordicum，发现肉座菌目真菌受正选择压力（Figure 3），rps3的36个序列位点受正选择压力（dN/dS >1），其中16个序列位点具统计显著性（P ≥0.95）(Table 2)。

Figure 3基于肉座菌目真菌rps3基因构建系统进化树

Table 2肉座菌目真菌rps3基因对数似然函数值及参数评估

4. 在冬虫夏草线粒体基因组中，确定了1604个修饰位点（正向链783个，反向链821个），平均modQV scor（特定修饰信息的一致性）为24.68，平均覆盖度在96×左右（Figure 4）。在其中确定了28个4mC（0.13%）和10个6mA（0.017%）的修饰位点，大部分6mA和4mC分布在基因间区或内含子区，仅有3个DNA甲基化分布在编码区nad2，nad4L，nad5（Table 3），研究推断其甲基化信息可能与冬虫夏草在寒冷及低PO2的高海拔环境生长适应性相关。

Figure 4 冬虫夏草线粒体基因组中DNA修饰

Table 3 冬虫夏草线粒体基因组的6mA和4mC信息 

PacBio SMRT测序技术的长读长有效解决了冬虫夏草的线粒体基因组中高AT区域或高重复区域难题，得到线粒体基因组完成图，准确定义了基因组特征和进化地位，这一优势也已延伸到科研项目中解决大基因组的复杂区域难题；同时，PacBio测序原始数据可直接用来检测基因组中DNA修饰信息，可让研究者从表观修饰信息角度挖掘与环境适应性相关的分子机制。

参考文献

Kang X, Hu L, Shen P, et al. SMRT sequencing revealed mitogenome characteristics and mitogenome-wide DNA modification pattern inOphiocordyceps sinensis[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1422.