未来组项目经验

2018年4月，未来组携手中国农业科学院生物技术研究所谷晓峰研究组和新加坡国立大学生物系及淡马锡生命科学研究所俞皓研究组合作在Developmental Cell杂志发表了题为“DNA N6-Adenine Methylation in Arabidopsis thaliana”的研究论文，利用PacBio三代测序技术获得模式植物拟南芥的全基因组6mA修饰图谱，解析其分布模式和潜在功能。

研究概述

研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平，后续选择D9和D21的样本进行三代PacBio SMRT全基因组测序，比较两个时期拟南芥6mA修饰的分布模型和动态变化，并结合转录组信息更深入地研究6mA潜在功能。

Highlights

• 6mA修饰在拟南芥基因组内广泛存在
• 与基因间区相比，6mA在 gene body区更丰富
• 在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态的
• 6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联

研究结果

6mA修饰在拟南芥基因组内广泛存在

研究人员首先使用Dot blot方法检测了在拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平，发现在这些样本中都广泛存在不同程度的6mA，其水平随着个体发育的进程逐渐增加，在D21出现了急剧上升。

Fig.1Dot blot方法检测拟南芥不同组织和不同发育时期的6mA修饰水平

使用PacBio SMRT测序获得拟南芥全基因组6mA图谱

Fig.2 链特异性的6mA修饰信息

以D9样本示例，PacBio SMRT测序深度经计算为103×，高于PB官方推荐的测全基因组甲基化的要求100×。通过测序时两个脉冲荧光信号之间的间隔时间评估该位点的甲基化程度（Fig.2），最终获得了链特异性的D9全基因组6mA信息(Fig.3A)。实验结果表明，在包含线粒体、叶绿体和核基因组中所有的29,811个腺嘌呤中，发生6mA碱基修饰的比例为0.04%，与LC-MS/MS实验中评估的0.048%吻合，并且发现在越靠近着丝粒区域表现出越高的6mA丰度和轻微降低的平均甲基化水平（Fig.4）。

Fig.3D9 (A)和D21 (B) 拟南芥全基因组6mA图谱

Fig.4 6mA丰度和水平在染色体臂上的分布情况

6mA分布模式解析

通过评估6mA在基因组内不同的区域（Exon、Intron、5’UTR、3’UTR区，Fig.5A）和位处基因的不同类型（Protein coding、miRNA、snoRNA等，Fig.5 B、C）分析6mA的分布模型得知：与基因间区相比，6mA在 gene body区更丰富（Table 1）。

Fig.5 6mA分布模式解析(D9)

在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态的

通过比较D9和D21拟南芥全基因组6mA分布图谱（Fig.3）、overlap关系（Fig.6）、分布模式的区别（Fig.5、7），可以得知在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态变化的，在位点、程度上都有明显的区别。

Fig.6 D9和D21拟南芥基因组中6mA分布比较韦恩图

Fig.7 6mA分布模式解析(D21)

Fig.8示例了2个基因在D9和D21两个发育阶段不同的6mA修饰位点。D21比D9拥有更多的6mA修饰位点。也支持了在拟南芥发育过程中，6mA修饰是动态变化的。

Fig.8 2个基因在D9和D21两个发育阶段不同的6mA修饰位点示例

6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联

通过将6mA修饰位点及程度与来自RNA-seq的基因表达信息结合分析，结果表明6mA与拟南芥中活跃表达的基因相关联。

高表达基因的TSS上下游2.5kb区域内有更多的6mA修饰位点（Fig.9 A、B）,高表达的基因有更多的6mA修饰位点（Fig.9 C、D）,被6mA修饰的基因比未修饰的基因表达水平显著增高（Fig.9 E、F），并且靠近TSS时，差异更明显。

Fig.9 6mA修饰与RNA数据关联分析

这篇论文是国内发表的首篇基于PacBio单分子测序技术进行真核生物6mA修饰分析的研究成果，揭示了拟南芥中6mA修饰的发生规律，并为研究陆生植物碱基修饰的分布模式和潜在功能提供基础。武汉未来组凭借丰富的三代测序项目经验在为该项目提供PacBio测序服务并参与分析。

其它真核生物6mA研究高分文章（三代测序直读）：

线虫

6mA甲基化对跨代遗传的影响

Greer, E.L. et al. DNA methylation on N6-adenine in C. elegans. Cell 161, 868–878 (2015).

小鼠

6mA在哺乳动物中可影响基因沉默

Wu, T.P. et al. DNA methylation on N(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature 532, 329–333 (2016).

真菌

从多种真菌三代基因组测序数据中挖掘甲基化信息

Mondo, S.J. et al. Widespread adenine N6-methylation of active genes in fungi. Nature Genetics (2017).

延伸阅读

NanoMod 发布，适配于纳米孔测序数据的碱基修饰检测工具

参考文献

Liang et al., DNA N6-Adenine Methylationin Arabidopsis thaliana, Developmental Cell (2018)

图片来源于网络｜侵删

随着测序技术的进步，数十年来人类基因组的研究得到了长足的发展，耗费的人力物力不断下降，组装的连续性和完整度不断提升，但仍有不少区域未得到充分解析，例如着丝粒、端粒等串联重复序列，这些区域往往被认为与细胞分裂、细胞周期、疾病等密切相关。

2018年3月，Nature Biotechnology 在线发表了一篇通过对BAC文库进行纳米孔（Oxford Nanopore）长读长测序，绘制人类Y染色体着丝粒区域线性DNA序列的方法学文章，解析了该区域长达数百kb的串联重复，不仅有助于了解着丝粒的进化和功能，更是为通过单分子测序的方法实现人类基因组完成图提供一种新思路。

具体实施步骤

1.建库测序

对目标区域（人Y染色体着丝粒DYZ3区）的环形BAC (https://bacpacresources.org/)使用转座子酶进行1次打断，形成线性DNA后加上测序接头，在Oxford Nanopore MiniION平台进行全长BAC DNA测序（R9.4，RAD002）。

Fig.1基于Nanopore的全长BAC DNA建库测序示意图

2.数据产出

每个BAC run产出数据读长分布见Fig.2, 从10个BAC文库（8个目标位点，2个对照）中，获得了＞3500条全长1D reads。每个BAC产出的总数据量、全长比例和一致性序列长度见Table 1。

Fig.2 10个BAC 产出数据读长分布

3. consensus、polishing和定位、定向

通过评估对照组的数据得知原始1D数据单碱基准确度为84.8%。经过一步consensus和polishing后得到高准确度的一致性序列（Fig.3 B、C），将全长reads比对到每个BAC的consensus reads，对照组准确度为99.2%，其它BAC为99.4–99.8%。

Fig.3数据一致性比对、polishing以及序列变异检测策略

在前一步提高序列准确度后，使用Illumina MiSeq对BAC进行了resequencing，实施了2种变异检测：（1）K-mer method和（2）Alignment metod （Fig.3 D），通过变异检测结果帮助对BAC序列进行定位和排序，例如Fig.3 D右侧圈图以209 kb 长的RP11-718M18示例，使用8个BAC-polished序列，按照从p-arm到q-arm的顺序拼接完整的该区段的序列。

4.组装结果

从8个BAC的Nanopore测序数据中，组装出了完整的人类Y染色体着丝粒区域：365Kb的α-卫星DNA序列。它包含着一段由5.8Kb的序列串联重复而形成的长达301Kb的特殊序列（Fig.4），包含52个higher order repeats（HOR），其中有7段6.0Kb长的HOR结构变异（Fig.4 紫色）。能通过4种常见的单核苷酸多样性而划分形成的9种单体型（Fig.5）。至此，人类Y染色体着丝粒区域DNA序列得到完整解析。

Fig.4 基于Nanopore的全长BAC DNA测序，构建人类Y染色体着丝粒DYZ3区

Fig.5CENY haplotype groupings

5.进一步研究着丝粒的进化和功能

研究人员后续对人类和其它一些类人猿种类的Y染色体着丝粒区域进行了荧光原位杂交（FISH）比对分析（Fig.6）、组蛋白表观修饰分析（Fig.7）等，以期更深入研究着丝粒的进化和功能。

Fig.6The Y centromere location is not shared among the great apes.

Fig.7Epigenetic characterization of the Y Centromere

研究人员在这篇论文中实现了利用BAC+Nanopore测序的方法获得完整的人类Y染色体着丝粒DNA序列（串联重复卫星DNA），比以往的研究更完整、更精细，对序列的顺序好和方向有了更准确的判断，为进一步研究着丝粒的进化和功能以及实现人类基因组完成图提供一种新思路，这也是Nanopore多变应用策略的一个体现。

参考文献

[1]Jain M, Olsen H E, Turner D J, et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome[J]. Nature biotechnology, 2018.

延伸阅读

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Nature methods丨基于Nanopore的direct RNA测序方法

转录组学研究可以在整体水平上研究细胞中所有基因的表达调控规律，在分子水平上反映个体的生理生化过程。二代测序技术的应用使得人们得以初探转录组，但由于其短读长的技术限制，始终无法准确获得完整转录本。而三代长读长测序技术PacBio SMRT以其平均15~20kb的长读长优势，可以轻松覆盖转录本全长，使得人们终于可以窥得转录本全貌，为人们获取个体全长转录本并进行差异化分析、了解生命内在规律提供了新的解决方案。以下组学君为您带来三篇全长转录组Iso-seq应用案例解析，看看能不能为您带来新思路。

案例一

构建空心莲子草叶甲全长转录本集合^[1]

Title：SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila

Journal：Science Reports（February 2018）

IF:4.259

空心莲子草是原产于南美的苋科植物，在十九世纪30年代进入中国并迅速成为入侵物种，对当地的生态系统造成了破坏。空心莲子草叶甲是空心莲子草的专性天敌，作为生物防治手段而被引入。研究者对其进行了全长转录组研究，获得较完整的转录本集合，为了进一步揭示空心莲子草叶甲与宿主植物和生态系统之间的互作关系打下基础。

材料与方法

物种：空心莲子草叶甲（Agasicles hygrophila）

取样：分别提取四个生长阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）的RNA后混合测序

测序策略：PacBio SMRT

结果分析

文章应用部分篇幅阐述了PacBio SMRT Iso-Seq与RNA-Seq相比的长读长优势（Table 1）：通过Illumina测序获得的reads读长有70%分布在200-300bp，而PacBio SMRT则有超过69%的reads读长超过1kb。Iso-Seq共产生9.4Gb clean数据，158,085条FLNC reads。完整地读取转录本的全长，有助于更精准地进行转录本重构和基因注释。

Table 1 PacBio SMRT与Illumina测序结果比较

文章基于PacBio SMRT数据，做了进一步的全长转录组标准分析，重构了28,982 条转录本，预测了145个可变剪接事件；27,318条简单重复序列；经TransDecoder鉴定获得24,040个ORF，其中有16,205个完整的ORF；预测得到4,198个lncRNA。同时，研究者还用多个数据库对空心莲子草叶甲基因进行了注释。

该研究利用长读长测序手段首次完成对空心莲子草叶甲的转录本研究，4分SCI妥妥到手，同时也为后续进一步研究昆虫与宿主植物和生态系统之间的互作关系提供了很有价值的参考信息。

案例二

比较转录组学：自然选择的摩擦草属VS人工选择的玉米^[2]

Title：Parallels between artificial selection in temperate maize and natural selection in the cold-adapted crop-wild relativeTripsacum

Journal：bioRxiv（September2017）

摩擦草属、玉米和墨西哥类蜀黍的亲缘关系很近，但摩擦草属对寒冷气候适应性更强。研究者利用三代Iso-seq获得摩擦草全长转录组，结合已发表的玉米参考基因组和蜀黍植物基因组数据，进行个性化比较分析，以期在不断变化的气候条件下，为人工培育农作物提供思路。

材料与方法

物种：摩擦草（Tripsacum）

取样：提取野生摩擦禾种子发芽生长的单一植株的根、叶和茎RNA后混样测序

测序策略：PacBio RSII

结果分析

选取摩擦草属和玉蜀黎属为目标物种，高粱属、狗尾草属、复活草属为背景物种，稻属、短柄草属为外参物种，构建系统进化树。发现摩擦草属和玉蜀黎属中的6,950个直系同源基因在七种草类物种共有，包括4,162个一对一，1,436个一对二和1,352个二对二直系同源基因集，说明玉米和摩擦禾可能拥有相同的全基因组复制情况，二者的亲缘关系很近。

Fig.1 系统进化树

利用PacBio Iso-seq测序技术获得摩擦草的全长转录组与玉米参考基因组(RefGen v3)进行比较分析，发现玉米转录组中包含更多的可变剪切事件，且在玉米和摩擦禾的直系同源基因中发现有超过2/3(656, 61.6%)的保守基因发生可变剪切，而409个基因是玉蜀黍属-摩擦草属所特有的；在摩擦草中发现249个lncRNA，平均长度1.45kb,比玉米用PacBio Iso-seq技术测得的lncRNA的平均长度（0.67kb）长，且仅有17个lncRNA与玉米表现为高度一致性。

Fig.2 (a)摩擦草和玉米之间Ka / Ks比值的分布散点图; (b)摩擦草中磷脂代谢基因与其他功能基因的Ka / Ks比值分布图

脂质具有防止细胞膜在低温条件下损伤的作用，因此膜脂质组成的变化可能是与摩擦草的耐冷性相关。研究者比较玉米和摩擦禾中相同基因之间的Ka / Ks值，发现磷脂生物合成途径中的基因显示比背景基因更高的Ka / Ks比值，说明参与磷脂代谢的基因加速了物种的进化过程（Fig.2）。研究指出摩擦草中参与磷脂代谢的相关基因中的蛋白质序列的加速进化可能是造成摩擦草属相对于玉米更耐寒的原因。

案例三

动态转录组监控裂殖酵母减数分裂过程中Isoform水平的多样性^[3]

Title:The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms

Journal：GenomeResearch（January 2017）

IF：11.922

可变剪接增加了后生动物转录组和蛋白质组多样性，但人们对于单细胞生物的可变剪接事件还知之甚少。研究者以裂殖酵母为模型，利用三代长读长测序技术的同时开发了SpliceHunter软件用以对其进行转录组的可变剪接事件进行动态分析。

材料与方法

物种：裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）

取样：在0-10h内间隔2h取样，分别提取RNA测序

测序策略：PacBio RSII

结果分析

从PacBio测序获得的Iso-seq reads 平均长度为1178 bp，共发现了S. pombe中~90%（6,199个）的基因。研究者发现在裂殖酵母的减数分裂时期，发现17,669个异构体，发生了14,353个可变剪切事件，其中，内含子保留是最主要的可变剪接形式（Fig. 3）。研究反映了裂殖酵母S. pombe转录本的复杂性：~1300个基因发生了一次可变剪接，1432个基因发生了两次可变剪接，而发生了2次以上的可变剪接事件的基因超过3000个。

Fig.3 S. pombe中的可变剪接事件

Fig. 4 减数分裂期间不同可变剪接形式的变化趋势

研究发现在裂殖酵母减数分裂期间，大部分的可变剪接类型都有所增加，仅有外显子跳跃类型的可变剪接在减数分裂初期处于低水平而在减数分裂末期有所增加（Fig.4）。这种变化反映了S. pombe在有丝分裂和减数分裂期间的一种条件驱动的可变剪接机制。研究结果反映了裂殖酵母性发育过程中Isoform水平的多样性和动态变化。

由此可见，基于三代长读长测序的Iso-seq技术跨越了传统测序技术无法克服的鸿沟，极大地丰富了对转录本结构的研究，可准确辨别二代测序无法识别的异构体（Isoform）、融合基因、lncRNA等，获得更加全面的注释信息。

未来组的全长转录组学研究，不仅包含PacBio SMRT技术，也已推出基于Nanopore的direct RNA测序技术，开启转录组学研究新纪元，我们有丰富的全长转录组项目经验，针对特定项目，对分析流程进行优化，以期为不同领域的研究者提供更为完善的解决方案。

参考文献

[1]Jia D, Wang Y, Liu Y, et al. SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 2197.

[2] Yan L, Lai X, Rodriguez O, et al. Parallels between artificial selection in temperate maize and natural selection in the cold-adapted crop-wild relativeTripsacum[J].bioRxiv, 2017: 187575.

[3]Kuang Z, Boeke J D, Canzar S. The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms[J]. Genome research, 2017, 27(1): 145-156.

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