橙色小丑鱼（Amphiprion percula）是海葵鱼科的一种，隶属于绒头鱼科（大鳞鱼），与海葵有着共生的关系，是研究珊瑚礁鱼类生态和进化的最重要的物种之一，也被用作研究社会组织模式和过程的模型物种。2018年3月在bioRxiv预印了一篇借助PacBio+Hi-C对橙色小丑鱼进行染色体级别参考基因组装的文章^[1]，研究结果显示，橙色小丑鱼是目前最连续、最完整的鱼类参考基因组之一，优于2018年已发表2个的二三代混合组装的小丑鱼基因组^[2-3]，也是第一篇利用Falcon_Unzip获得的单体型水平的鱼类基因组。

Table1.三个已发表的的小丑鱼基因组测序策略和组装指标比较

这三篇论文应用了不同的组装策略，通过比较得知：

• 三代长读长数据（PacBio/Nanopore）的引入有助于提高基因组组装的连续性
• ＞100×纯三代组装能将Contig N50提升到Mb级别，与二代或者二三代混合组装相比，提升效果＞10倍。
• 如果同时辅以Hi-C技术，更能将Contigs聚类到染色体群，并可以对Scaffolds进行定向。

橙色小丑鱼文章亮点

1.chromosome-scale和haplotype level的组装

研究人员对橙色小丑鱼进行了121×的PacBio测序，对过滤后的数据进行多版本组装，挑选其中质量最佳的版本A7进行后续分析（基于组装基因组大小、contig N50、BUSCO评估等多指标综合考虑选择）。随后使用FALCON_Unzip解决单体型级别的组装和phasing；使用Quiver提高组装准确度；结合来自于大脑组织的Hi-C数据，将contigs聚类到染色体；使用PBJelly尽可能地填补gaps；最终得到chromosome-scale、haplotypelevel、phased的橙色小丑鱼参考基因组（Nemo v1）。

2.目前最连续、最完整的鱼类参考基因组之一

比较橙色小丑鱼和已有的26个染色体级别鱼类参考基因组的组装连续性(Contig N50比较，Fig.1)和完整度(BUSCO评估，Fig.2)，本研究中的橙色小丑鱼是目前最连续、最完整的鱼类参考基因组之一。

染色体级别鱼类参考基因组文献汇总及下载方法请见文末。

Fig.1 27个染色体级别鱼类参考基因组的组装连续性比较

从研究结果中可知，三个contig N50＞1Mb的参考基因组，都是基于三代长读长测序获得：

Nile tilapia (3.09 Mb,Canu),

orange clownfish (1.86 Mb,Falcon)

Asianseabass (1.19 Mb, HGAP)

Fig. 2 27个染色体级别鱼类参考基因组的组装完整度比较

3.橙色小丑鱼特有基因鉴定

通过比较橙色小丑鱼、剑尾鱼、罗非鱼、斑马鱼和尖吻鲈五种鱼类的直系同源基因家族，查找橙色小丑鱼所特有的基因。研究发现，这五个鱼类物种的蛋白质序列间具有很高的相似度，绝大多数(89%)的序列能被归集到19,838个直系同源群中，其中14,783个直系同源群(75%)是五个鱼类物种所共有的，推测这些共有基因对应的蛋白质基本上都属于硬骨鱼类的核心基因集群。通过单拷贝直系同源基因构建的进化关系（Fig.3B）与以往的研究一致。

鉴定了橙色小丑鱼特有4,429个序列，其中49%具有功能注释（Fig.3A），未来进一步研究将以这些特有unique基因对橙色小丑鱼的表型性状的影响为关注点。

Fig. 3 (A)五个鱼类直系同源基因家族的overlap关系

(B)五个鱼类系统发生关系

nOG：直系同源基因群数量   nSOG：特有的直系同源基因群数量

4.小丑鱼基因组data base

研究人员还搭建了Nemo小丑鱼基因组data base，提供全球化的小丑鱼组学数据开放共享平台，数据库链接：http://nemogenome.org

该论文使用PacBio +Hi-C 的方法获得染色体级别的参考基因组，通过与已发表的染色体级别鱼类参考基因组做比较，证明自身组装的连续性和完整度都名列前茅，鉴定目标物种所特有的基因以为后续研究提供候选，为进一步研究基因和表型之前的关系打下基础。

未来组在三代测序基因组学领域项目经验丰富，竭诚为合作伙伴打造高质量的参考基因组。

附：论文中提到的27种染色体级别的鱼类参考基因组  组装策略及指标汇总表

参考文献

[1] Lehmann, Robert, et al.”Finding Nemo’s Genes: A chromosome-scale reference assembly of the genomeof the orange clownfish Amphiprion percula.” bioRxiv (2018): 278267.

[2] Tan, Mun Hua, et al.”Finding Nemo: Hybrid assembly with Oxford Nanopore and Illumina readsgreatly improves the Clownfish (Amphiprion ocellaris) genome assembly.”GigaScience (2018).

[3] Marcionetti, Anna, et al.”First draft genome of an iconic clownfish species (Amphiprionfrenatus).” Molecular ecology resources (2018).

图片来源于网络｜侵删

2018年2月18日，bioRxiv同时预印两篇使用Oxford Nanopore测序组装果蝇基因组的论文，两个不同机构的研究人员不约而同选择了时下最热门的纳米孔测序手段来获得果蝇的基因组，侧面反映出大家对这个技术的关注是so hot~。如果您也有意尝鲜组学新技术，当然请联系未来组。

以下是两篇文献的简单介绍

论文一 一种黑腹果蝇基因组组装

研究中使用黑腹果蝇D. melanogaster (ISO1)基因组DNA在Oxford Nanopore MinION掌上测序仪上测序1个 flowcell，以其中长度在1kb以上的reads（约30×的测序深度）与二代数据结合进行混合组装，加上Bionano光学图谱数据辅助scaffolding，获得高准确度、高连续度和高完整度的基因组组装结果：Contig N50:18.9Mb，BUSCO评估97.1%。

通过与参考基因组进行比较，揭示了大量结构变异，包括与发育、行为、代谢基因相关的novel LTR转座元件的插入和复制等，这些结构变异有助于研究后生动物基因组进化。

文中提到完成该基因组的费用不超过$1,000。

参考文献

SOLARES,Edwin A., et al. Rapid low-cost assembly of the Drosophila melanogasterreference genome using low-coverage, long-read sequencing. bioRxiv,2018, 267401.

论文二 15种不同的果蝇基因组组装

研究对果蝇属的15种果蝇进行了平均深度29×的Nanopore测序，使用minimap2 和miniasm快速组装，平均Contig N50: 4.4Mb。经过自身校正和二代校正后，BUSCO评估数值平均为97.7%。

通过与这些果蝇以往参考基因组对比，结果表明，平均填补了参考基因组中约60%的gap（Table 2）说明长读长测序数据的引入，有助于提高基因组组装的连续度和完整度。Fig.1 以D. erecta参考基因组中Scaffold_4845和本研究中对应的Contig（utg0000101）对比为例，展示了以Nanopore数据组装获得的一个17.4Mb的contig（utg0000101）填补了参考基因组中由38个contigs组成的Scaffold 4845中的gaps，解析了3.7 Mb参考基因组中的未知序列。

Fig.1参考基因组中的gaps能被长读长测序数据填补 

文中也提到，每个基因组的费用都未超过$1,000。

参考文献：

MILLER,Danny E., et al. High-quality genome assemblies of 15 Drosophila speciesgenerated using Nanopore sequencing. bioRxiv,2018, 267393.

长读长Nanopore测序数据的引入能明显增强基因组组装的连续性和完整度，为进一步深入研究种群结构遗传变异的进化和功能打开了一扇门。Nanopore 更高通量的新款测序仪PromethION已经上市，每个Run理论产出6.2TB，未来单GB数据价格会进一步下降，敬请持续关注。

未来组于2017年引进Oxford Nanopore平台，在2018年初率先获得Oxford Nanopore测序认证服务供应商资质认证。未来组将持续扩大Oxford Nanopore测序平台，打造包含三代单分子测序、光学图谱、三维基因组学等多方位的组学研究中心，还将在RNA直接测序、表观转录组学等领域进行深度的探索。

组学新技术尝鲜当然要找未来组

延伸阅读

Nanopore组装动植物基因组盘点及文献下载

里程碑丨Nanopore测序组装人类基因组终见刊NBT，牛津纳米孔公司携手未来组推“1000个中国人基因组结构变异检测计划”

未来组–中国首家通过Nanopore官方测序服务认证

Naturemethods丨基于Nanopore的direct RNA测序方法测评，你要不要来试试？

Oxford Nanopore Technology（ONT）的概念从上个世纪80年代就提出来，但从理论到商业化应用，走了二十多年。2014年，ONT对外提供MinION试用项目计划（MAP），随后几年不断对早期版本仪器的高错误率和低通量问题进行改善。从2016年开始，Nanopore平台通量得到较大提升，错误率也显著降低，在基因组中的应用已从小基因组逐渐延伸到复杂动植物基因组中的应用，而更高通量平台GridION X5 和PromethION的发布将对Nanopore在复杂物种中的应用更为简单和便捷。

高质量的参考基因组是深入进行物种起源进化和基因功能研究的前提，利用Nanopore长读长测序技术，读长最高可达>1Mb，克服高杂合、高重复、多倍体等组装难题，有助于获得更完整、更连续的参考基因组。近两年已有数篇基于Nanopore数据的基因组文章发表，请听组学君娓娓道来。

NBT丨~30×普通reads+5×ultra long reads组装人类基因组，NG50: ~6.4 Mb^[1]

文章在2017年4月预印，2018年1月29日正式发表于Nature Biotechnology。研究结果显示：低覆盖深度测序（~30×普通nanopore reads+ ~5× ultra-long reads）即能将基因组Contig N50组装到6.4Mb，填补了参考基因组（GRCh38）中12个gap，是来自单一测序手段得到的迄今最连续的人类的基因组。

NC丨单个Nanopore flowcell数据组装拟南芥基因组，N50高达12Mb^[2]

文章在2017年6月预印，2018年2月正式发表于Nature Communications。文中使用便携式U盘大小Nanopore MinIon对拟南芥(KBS-Mac-74 accession)测序1 flow cell，使用家用电脑水平的硬件（4核，16Gb RAM），耗时4d完成组装。

随着测序仪价格平民化，旧时王谢堂前燕，已飞入寻常百姓家。日后随着测序成本进一步下降，即使仅为了解基因组单个区域的复杂结构变异，组装完整的基因组也将成为实现这一目标的最简单的方法。

PC丨第一个正式发表的Nanopore大型植物基因组，野生番茄^[3]

2017年10月，野生番茄（Solanum pennellii）基因组文章发表于The Plant Cell。31个MinION flowcell测序，通过Canu-SMARTdenovo组装，得到了高质量的番茄基因组。Contig N50 达2.45 Mb，经Nanopolish及pilon迭代校正后，碱基错误率<0.02%，基因组完整性评估96.53%。

研究者最后粗略估算了下成本，对于这种中等大小的植物基因组（<2Gb）的Nanopore测序，在当时当地情况下，项目预算低于$25000，其他开销主要是计算资源，人力成本和耗损等。另一方面，Nanopore测序下机数据含有CpG甲基化数据信息，在不需要增加成本的情况下，可利用甲基化信息对物种进行深层次的表观关联研究。

Genome Research丨秀丽隐线虫基因组^[4]

文章于2017年1月预印，2018年2月正式发表于Genome Research。文中借助Oxford Nanopore测序技术对秀丽隐杆线虫的两个品型（野生型；带有两个复杂染色体重排区域的突变型）进行了全基因组测序，通过~60×Nanopore数据，组装出野生型秀丽隐杆线虫基因组（仅由48个contig组成，N50达3.99Mb，覆盖了参考基因组>99%的区域），完善了秀丽隐杆线虫参考基因组，并基于高质量的参考基因组研究突变型中复杂的重排机制。

BMC Biology丨巴西日圆线虫基因组^[5]

文章2018年1月发表于BMC Biology，研究者以巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）为材料，采用目前读长最长的Oxford Nanopore测序技术，对其基因组进行de novo组装，并加入二代参考基因组进行比较，结果显示：基于长读长的基因组组装，能更好地覆盖串联重复等复杂区域。

目前正式发表的纯Nanopore de novo组装动植物基因组就是这5篇文章[1-5]，另外还有Nanopore+Illumina混合组装案例，墨瑞鳕鱼、欧洲鳗、耐盐水稻、小丑鱼，请见如下汇总表^[6-9]。文献下载请见文末。

随着高分文章的发表，Nanopore技术的应用日渐成熟，并被广泛认可。Oxford Nanopore公司也在改进其价格、准确度、读长、产量、便携性等方面持续发力，比如即将推出的更高通量的PromethION测序仪，拥有3000个通道和单个flow cell 120G的产量，48h内产量可达6.2T，为更大规模更复杂物种的基因组快速测序提供了可能。而产量的提高必然会带来价格的下降，也将会促进各个方面应用，除了动植物基因组de novo测序，2018年Nanopore还将会在重测序、结构变异检测、目标区域捕获测序、全长16s测序、宏基因组测序、甲基化测序等领域升级应用，尤其是转录组研究领域，direct RNA sequencing将会有一波新的应用场景。另外直接蛋白质测序，也是非常值得期待的亮点之一。在提高测序读长和碱基准确度方面也在持续改善，1D2文库搭载R9.5芯片，可使单碱基原始准确率提高到95%左右；ultra long 建库方式，可获得N50接近100k，最长超过1M的Reads。这使得动植物基因组完成图，多倍体物种单倍体分型等不再遥远。

参考文献

[1] Jain M,Koren S, Miga KH, etal. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.Nature Biotechnology, 2018

[2] MICHAEL,Todd P., et al. High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell. Nature Communications, 2018, 9.1: 541.

[3] SCHMIDT,Maximilian H.-W., et al. De novo assembly of a new Solanum pennellii accession using nanopore sequencing. The Plant Cell, 2017, 29.10: 2336-2348.

[4] TYSON, JohnR., et al. MinION-based long-read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome. Genome research, 2018, 28.2: 266-274.

[5] ECCLES,David, et al. De novo assembly of the complex genome of Nippostrongylus brasiliensis using MinION long reads. BMC biology, 2018, 16.1: 6.

[6] AUSTIN,Christopher M., et al. De novo genome assembly and annotation of Australia’s largest freshwater fish, the Murray cod (Maccullochella peelii), from Illumina and Nanopore sequencing read. GigaScience, 2017, 6.8: 1-6.

[7] JANSEN,Hans J., et al. Rapid de novo assembly of the European eel genome from nanopore sequencing reads. Scientific Reports, 2017, 7.1: 7213.

[8] MONDAL,Tapan Kumar, et al. First de novo draft genome sequence of Oryza coarctata, theonly halophytic species in the genus Oryza. F1000 Research, 2017, 6.

[9] TAN, MunHua, et al. Finding Nemo: Hybrid assembly with Oxford Nanopore and Illumina reads greatly improves the Clownfish (Amphiprion ocellaris) genome assembly.GigaScience, 2018.

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