关于杜仲(Eucommia ulmoides)

杜仲是我国特有的、除三叶橡胶外世界上具有巨大开发前景的优质天然橡胶树种和名贵药用树种，国家二级保护野生植物。杜仲能耐严寒，成株在-30℃的条件下可正常生存，张家界、神龙架都有分布。获得高质量的参考基因组，解析杜仲环境适应及杜仲胶生物合成机制，对研究杜仲的起源和进化，遗传改良具有里程碑意义。

2017年11月，中国林业科学研究院经济林研究开发中心乌云塔娜团队、杜红岩团队，联合中国热带农业科学院橡胶研究所李德军团队及山东贝隆杜仲生物工程有限公司高瑞文团队合作完成耐寒橡胶树-杜仲基因测序和转录组研究，相关成果在线发布于《Molecular Plant》。

未来组在本项目中负责完成基因组测序、Bionano辅助拼接，基因组组装、基因注释和转录组测序分析等部分的工作。

材料与方法

基因组

神农架野生杜仲叶

二三代混合测序并BioNano辅助组装，转录组辅助基因组注释

转录组

同一棵杜仲不同生长发育时期的叶和果实进行RNA-Seq

结论

基因组组装和注释

预估基因组大小1.1Gb，组装基因组大小1.18Gb，重复序列~61%，杂合度0.8%，

Scaffold N50：1.88 Mb，注释了26,723个蛋白编码基因。

通过转录组数据、ESTs数据比对，以及CEGMA和BUSCO分析评估组装基因组的完整度和准确度，结果表明基因组组装效果good。

基因组起源和进化分析

通过分析单拷贝基因，构建杜仲与14种植物的系统发生关系（Fig.1），研究表明杜仲与真菊I类和II类的分化时间可追溯到约在一亿两千九百万年前。

Fig.1杜仲遗传起源

通过同义替代突变分析（Fig.2左），以及与3个已知物种（葡萄发生过1次基因组倍增，番茄发生过2次倍增，猕猴桃发生过3次倍增）进行共线性关系比较（Fig.2右）得知，杜仲仅经历了一次古老的基因组三倍化事件，无近期基因组复制发生。

Fig.2杜仲基因组倍增事件分析

影响环境适应性的基因

杜仲是从历经了白垩纪存活下来的活化石，有着极高的抗逆性，文章对杜仲的环境适应性相关基因进行了分析，筛选了与环境耐受性和次生代谢相关的扩张基因。

杜仲的生物胶合成

通过RNA-seq分析同一棵杜仲不同生长发育时期的叶和果实中杜仲胶合成相关基因的表达水平，并结合这些样本中生物胶的含量检测，得出结论：杜仲中生物胶的前体物质异戊二烯焦磷酸（IPP）可能主要来自甲瓦龙酸途径（MVA途径）（Fig.3）。

Fig.3与杜仲胶相关的基因、代谢通路和表达谱分析

杜仲胶由反式聚异戊二烯(TPI)形成，橡胶树橡胶由顺式聚异戊二烯(CPI)形成。小橡胶颗粒蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)被推测与生物胶合成相关，在杜仲和橡胶树中，REF/SRPP基因家族都存在显著扩张，而与橡胶树SRPP和REF基因同时参与CPI合成不同，在杜仲中只有SRPP基因参与TPI合成，REF基因皆为低表达甚至无表达（Fig.3）。

法尼基焦磷酸合酶(FPS)是生物胶合成途径中的一种关键酶，杜仲FPS基因家族存在扩张并出现功能分化，产生了具有反式长链橡胶合成功能的II类FPS基因(Fig.4 a)。进化分析显示，杜仲和橡胶树的REF/SRPP基因家族成员属不同分支(Fig.4 b)。

Fig.4 FPS/REF/SRPP基因家族系统发育分析

研究人员综合分析结果，绘制了橡胶树橡胶(顺式聚异戊二烯，CPI)和杜仲胶(反式聚异戊二烯，TPI)合成途径及关键酶(Fig.5)，推测双子叶植物中橡胶生物合成为多起源。

Fig.5杜仲和橡胶树的产胶生物途径比较

中国林业科学研究院经济林研究开发中心等研究团队首次获得了杜仲高质量基因组序列并解析了杜仲环境适应及胶生物合成机制，对杜仲生物学研究、良种培育、种植及产业链形成具有重要意义。

PacBio长读长测序和BioNano光学图谱技术的引入，对杜仲基因组的组装连续性有了很大的帮助。未来组拥有Sequel、Nanopore、BioNano及Hi-C等平台，同时搭载天河二号和阿里云服务器，在承诺高标准交付指标的同时，将进一步大幅压缩项目服务周期，为合作伙伴提供专业优质的服务。

参考文献

Wuyun T,Wang L,Liu H,et al.The hardy rubber tree genome provides insights into the evolution of polyisoprene biosynthesis[J].Molecular Plant,2017.

萤火虫可以通过发光细胞中的荧光素和ATP，在荧光素酶的催化作用下，与氧发生化学反应，形成氧化荧光素并且发出荧光。萤火虫发出的荧光是一种冷光，其发光效率可高达98%左右。

萤火虫可以利用荧光的闪烁节奏形成特定的闪光信号，主要用来吸引异性交尾，偶尔也起一定的警戒作用。这种行为与蟋蟀鸣叫，蝴蝶起舞等类似，都可归为求偶行为，因为场面过于浪漫，被人们赋予更多诗意。

夏夜、繁星，微风吹拂，蒲扇轻摇，流萤如一盏盏悬空点燃的小灯笼，舞动出独属夜的宁静和美妙。然而，这些可爱的小精灵如今却难觅踪迹。萤火虫家族急速缩减，有几个主要原因：一是过度砍伐森林或过度景观开发导致萤火虫栖息地被直接破坏；二是光污染；三是农药的使用；四是水污染。

2016年4月，未来组联合中国最权威的萤火虫自然保护研究中心——守望萤火，共同启动对萤火虫的基因组测序研究。依托守望萤火研究中心多年的物种保护和研究经验，对萤火虫基因组进行深度测序，将有助于我们理解这种萤火虫独特的闪光求偶行为，保护萤火虫生物多样性，进而守望萤火，守护美丽和惊奇。

胸窗萤（Pyrocoelia pectoralis）

胸窗萤基因组大小预估为785Mb，杂合度在2%-3%，有约>40%属于重复序列，这些特性都是构建参考基因组过程中需要面临的困难。

Fig.1 基因组survey k-mer分析图

未来组通过高深度的PacBio测序，加上二代数据校正，以及去除组装基因组冗余，最终构建高质量的参考基因组（760.4Mb），覆盖预估基因组大小的96.9%，contig N50=3.04Mb，是迄今为止除了模式动物果蝇之外，基因组组装连续性最高的昆虫基因组，经过BUSCO评估基因完整性很好（Table 1）。

通过转录组reads和注释的unigenes评估基因组注释情况，有98%的unigenes可以比对到基因组上（Table 2）

未来组为构建高杂合高重复序列的复杂昆虫基因组，搭建个性化work flow（见后图），据此获得的高质量的萤火虫基因组，为进一步研究荧光的产生，特殊的求偶行为提供基础。

work flow

多倍体化事件增加了基因组的复杂性，帮助克服极端环境，是推动植物进化的主要动力，在物种的演化过程中起了举足轻重的作用。然而多倍体物种的转录组分析，长久以来受限于二代测序读长偏短，不仅无法准确重构转录本，更无力探究各亚基因组间的isoform结构差异及基因如何选择性保留。

自PacBio全长转录组测序不断普及，以及高粱和玉米两篇全长转录组文献高调亮相Nature Communications引起广泛关注，研究人员开始尝试将这种新技术应用到多倍体物种的转录组研究中，以下是几篇多倍体物种PacBio SMRT 全长转录组文献统计，供大家参考。

本次为大家解读四倍体阿拉比卡种小粒咖啡(2n=4x=44)全长转录组文献[3]，感受“全长转录组测序让多倍体物种isoform重构和亚基因组phasing不再是难题”。

阿拉比卡种小粒咖啡（Coffea arabica）为世界上最为广泛种植的咖啡品种，是由C.canephora和C.eugenioides杂交并基因组加倍形成的异源四倍体，其两个祖先种在味道、咖啡因含量、生存环境等方面有着显著的差别。C. arabica虽风味口感优质但对种植环境要求高、抗病虫害能力较弱，因此研究亚基因组基因表达调控，利于培育不仅美味而且更易种植的品种。

1材料与方法

随机选取Coffea arabica var. K7品系的不同植株，不同部位，不同发育阶段共计450 个果实。经样本前处理、RNA提取，反转成cDNA后，根据PacBio Iso-Seq protocol，分片段构建Pacbio RSⅡ文库并测序。（目前新一代PacBio Sequel测序仪可构建不筛分片段的转录组文库，更接近真实地还原物种转录本片段分布情况）

通过转录组注释、同源基因比对、候选基因筛选等一系列生物信息分析，筛选出与咖啡因、蔗糖合成相关的基因的isoforms，并与相关数据库比对。

2研究结果

咖啡因合成途径中isoform多样性

咖啡因的合成途径前期已有广泛的研究，已有比较完善的数据库提供候选基因和编码序列信息（转录组和基因组数据都有），在这篇四倍体小粒咖啡的论文中，研究人员找到了10个可能与咖啡因合成相关基因的高质量isoforms，并且发现这些isoforms都发生了5’非翻译区延伸。

Table1 咖啡因合成途径相关候选基因注释，isoforms及5’非翻译区延伸情况

这10个isoforms中，有9个比基因组DNA序列长，而有一个isoform可能因为发生了可变聚腺苷酸化(APA)而短于基因组DNA序列(Fig.2 c)，在3‘UTR检测到2个潜在的APA信号(Fig.2 d)。

Fig.2 一个isoform(c25904/f2p0/977)可能因APA事件而短于基因组DNA序列

这些咖啡因合成相关的基因也存在可变剪切现象（AS），以下为DXMT2基因内含子保留AS示例(Fig.3)。

Fig.3DXMT2基因内含子保留AS示例

异源四倍体小粒咖啡转录组的isoforms表现出较明显不同的亚基因组来源，通过与已发表的祖先种之一C. canephora的转录组数据进行比对，XMT1、MXMT1、DXMT2基因的isoforms与C. canephora的isoforms有较好的一致关系，表示这些isoforms可能来源于C. canephora亚基因组；相反，XMT2、MXMT2、DXMT1与C. canephora的isoforms比对率不高，表明他们可能来源于另一个C.eugenioides亚基因组。

通过重构isoform初探复杂多倍体亚基因组的基因表达

通过PacBio 全长转录组测序，可准确地重构小粒咖啡的转录本信息，以蔗糖合成途径中非常重要的基因SS1为例，研究人员发现了9个转录本异构体，包括替换、缺失、内含子保留等多种可变剪接形式。

Fig.4 蔗糖合成相关基因SS1多种可变剪接形式

随后，同样通过与祖先种之一C. canephora的转录组数据进行比对，分析比对率和相同的核苷酸变异（Fig.5），以此推断单个isoform来源于哪个亚基因组。例如Fig.5中第1行（标黄）为祖先种之一C. canephora SS1基因序列，将小粒咖啡的多个isoforms的一致性序列与其进行比对，第2-5行的isoforms与C. canephora表现出高度的一致性，并共同在3,726 bp处有一个A-G的碱基替换，与第6-10行相比，在3,707bp、3,733bp处有着同样的inset、在3,713bp、3,715bp处有着同样的碱基替换，以此将isoforms的来源区分开。

Fig.5 SS1基因多个isoforms一致性序列中的碱基变异比较

第二个有力的证据是，第6-10行的isoforms与C. canephora相比较，在内含子10区域，有着更高的变异。

另外还可以通过等位基因加以佐证。

可变剪接、可变聚腺苷酸化、5’UTR延伸、亚基因组拷贝数这些因素的综合作用，形成了转录本的多样性，本文以咖啡和蔗糖合成途径相关基因为例，以PacBio SMRT长读长测序为技术手段，完成四倍体小粒咖啡 isoforms重构和亚基因组复杂、多样的基因表达研究，为其它多倍体物种基因表达调控研究提供参考。

未来组凭借率先引进PacBio Sequel平台的优势，已完成十余个多倍体动植物转录组测序分析，在多倍体物种isoforms重构和亚基因组phasing方面经验丰富。

引用文献

[1]Clavijo B J, Venturini L, Schudoma C, et al. An improved assembly and annotation of the allohexaploid wheat genome identifies complete families of agronomic genes and provides genomic evidence for chromosomal translocations[J]. Genome research, 2017, 27(5): 885-896.

[2]Wang M, Wang P, Liang F, et al. A global survey of alternative splicing in allopolyploid cotton: landscape, complexity and regulation[J]. New Phytologist, 2017.

[3]Cheng B, Furtado A, Henry R J. Long-read sequencing of the coffee bean transcriptome reveals the diversity of full-length transcripts[J]. GigaScience, 2017.