近日，由湖南农业大学研究团队完成，未来组参与的冬虫夏草线粒体基因组项目文章见刊Frontiers in Microbiology。研究经PacBio SMRT测序技术，解析了冬虫夏草线粒体基因组完成图，并构建肉座菌目真菌系统进化分析，为冬虫夏草的分类地位提供了遗传学证据，同时，对线粒体基因组范围的DNA甲基化修饰进行分析，为目前首篇研究真菌线粒体基因组表观修饰的论文报道。

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是冬虫夏草菌感染蝠蛾幼虫而形成的冬虫夏草菌子实体与僵虫菌核（幼虫尸体）构成的复合体，是中国传统名贵中药材，主要产于中国西藏高原等高寒地带和雪山草原。冬虫夏草线粒体基因组完成图的获得可对冬虫夏草的进化和系统分类进行深入分析，同时，在PacBio测序中，带有甲基化修饰的DNA碱基会出现荧光脉冲信号的延迟，可直接被识别检测到，因此从测序原始数据中直接获得冬虫夏草线粒体基因组的甲基化信息，也为肉座菌目真菌线粒体基因组的表观修饰的进一步研究提供参考。

研究方法

采集冬虫夏草子实体进行DNA提取；质检合格后，构建20kb文库，上机PacBio RS II测序，P6C4，8个SMRT cell；将过滤后数据与已公布的201个真菌线粒体基因组比对，提取属于线粒体的序列，经HGAP组装；后进行线粒体基因组注释、甲基化和进化分析。

研究结果

1. 经组装，得到成环的冬虫夏草线粒体基因组57,539bp，含有14 个保守蛋白编码基因（PCGs）， 1个rps3， 27个 tRNAs和 2个 rRNA，其中AT含量占69.8%。另外，冬虫夏草线粒体基因组中内含子54个，与肉座菌目其他真菌相比数量最多，分析还确定了73个ORFs（Figure 1 和Table 1）。

Figure 1冬虫夏草线粒体基因组圈图

Table 1 肉座菌目真菌线粒体基因组特征对比

2. 基于14个与OXPHOS系统相关的保守PCGs做ML系统进化树分析，分类结果确定了冬虫夏草在虫草科中的分类地位，再次更正了之前经冬虫夏草形态学分类到Cordycepssp. 的错误（Figure 2）。

Figure 2基于冬虫夏草线粒体基因组中14个PCGs ML系统进化树

3. 基于19个肉座菌目真菌rps3基因构建的进化关系，发现与上述基于PCGs的系统进化关系有差别，在对肉座菌目中rps3基因的选择压力分析中，加入了外群P. nordicum，发现肉座菌目真菌受正选择压力（Figure 3），rps3的36个序列位点受正选择压力（dN/dS >1），其中16个序列位点具统计显著性（P ≥0.95）(Table 2)。

Figure 3基于肉座菌目真菌rps3基因构建系统进化树

Table 2肉座菌目真菌rps3基因对数似然函数值及参数评估

4. 在冬虫夏草线粒体基因组中，确定了1604个修饰位点（正向链783个，反向链821个），平均modQV scor（特定修饰信息的一致性）为24.68，平均覆盖度在96×左右（Figure 4）。在其中确定了28个4mC（0.13%）和10个6mA（0.017%）的修饰位点，大部分6mA和4mC分布在基因间区或内含子区，仅有3个DNA甲基化分布在编码区nad2，nad4L，nad5（Table 3），研究推断其甲基化信息可能与冬虫夏草在寒冷及低PO2的高海拔环境生长适应性相关。

Figure 4 冬虫夏草线粒体基因组中DNA修饰

Table 3 冬虫夏草线粒体基因组的6mA和4mC信息 

PacBio SMRT测序技术的长读长有效解决了冬虫夏草的线粒体基因组中高AT区域或高重复区域难题，得到线粒体基因组完成图，准确定义了基因组特征和进化地位，这一优势也已延伸到科研项目中解决大基因组的复杂区域难题；同时，PacBio测序原始数据可直接用来检测基因组中DNA修饰信息，可让研究者从表观修饰信息角度挖掘与环境适应性相关的分子机制。

参考文献

Kang X, Hu L, Shen P, et al. SMRT sequencing revealed mitogenome characteristics and mitogenome-wide DNA modification pattern inOphiocordyceps sinensis[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1422.

普通小麦基因组高达17Gb，为异源六倍体AABBDD类型，且含有80%的重复序列，使得小麦基因组解密历程艰辛。研究学者面对困难，勇敢直前，一步一步地绘出不同小麦基因组图谱。近期，研究者再次添砖加瓦，于Science发表野生二粒小麦基因组研究成果。

解析野生二粒小麦基因组AABB

现代的六倍体小麦AABBDD Triticum aestivum是经异源四倍体野生二粒小麦Triticum turgidum（WEW）驯化为有脱粒特性的现代二粒小麦（DEW）后，与二倍体DD Aegilops tauschii杂交形成。野生二粒小麦基因组的解析将可以从另外一个角度了解小麦的进化。

基因组组装

WEW基因组在测序策略上，构建了不同大小插入片段文库，经176x 深度的Illumina测序组装，组装10.1G基因组，Contig N50 57.37k，经遗传图谱和Hi-C进一步验证组装，最后得到Scaffold N50=6.96M，将基因组锚定到染色体上，然而，其中不确定的Scaffolds有0.4Gb，Scaffolds间gaps有~1.5Gb，经BUSCO评估，基因组组装完整度在98.4%。

注释及进化分析

WEW的2个亚基因组的同源性分析，发现其中72.3%同源基因对，同源基因对的表达模式和表达水平相似。另外少量同源基因对只在一个亚基因组中表达，功能富集分析表明，亚基因组调控的基因表达可能与小麦品种相关。

在WEW基因组注释中，预测了82.2%转座子序列，大多数转座子元件为长末端重复反转录转座子LTR-RTs，不同类型的转座子在2套亚基因组中含量相似。而大部分全长LTR-RTs在150W年前发生扩张。Ty3和未分类的转座子在A与B亚基因组中类似，而Ty1/copia发生在500W年前，这与A和B亚基因组杂交的预计时间相一致。

为了进一步研究不落粒的驯化性状，对Zavitan和Svevo杂交，发现了调控脆性BR表型的基因区域，其中包括WEW染色体3A和3B上的2个位点(15.5Mb，32.5 Mb)，确定了小麦基因(chromosome-3A: TtBtr1-A和 TtBtr2-A；chromosome-3B: TtBtr1-B 和TtBtr2-B)。在栽培种中TtBtr1等位基因在编码区发生突变，而在栽培种和野生种中，TtBtr2未发生编码区突变，推断2个基因中的突变是互补的，获得R栽培表型。

通过外显子测序，驯化和野生二粒小麦显著分离成2个亚群，野生二粒小麦分布以色列、叙利亚、黎巴嫩和土耳其地区，栽培二粒小麦分布印度洋、地中海、东欧和高加索地区，与野生小麦相比，栽培小麦的多样性下降。

小麦基因组解密历程艰辛

面包小麦即普通小麦（Triticum aestivum）是世界上种植面积广泛的农作物，是全球重要的粮食作物。普通小麦基因组不仅规模大（高达17Gb），而且基因组复杂，为异源六倍体AABBDD类型，含有3套亚基因组，亚基因组间相似性高，无法定位基因来自哪套染色体，且含有80%的重复序列，这些都使得小麦基因组解密历程艰辛。

异源六倍体小麦基因组的常规测序策略是通过构建BAC文库，结合鸟枪法测序；在材料选择上，会选择从小麦的二倍体供体开始基因组测序，为下一步深入解析六倍体小麦基因组及驯化、重要农艺性状等研究做参考。

下面组学君盘点了已发表小麦基因组的几个典型。

2012年11月，Nature，Triticum aestivum，AABBDD

利物浦大学、加州大学戴维斯分校等 9所研究机构合作对小麦基因组进行了测序。研究中经454测序平台对普通小麦栽培品种Chinese Spring基因组进行测序组装，并与其二倍体祖先基因组比较，确定了9万多个基因。分析发现普通小麦在多倍化和驯化过程中，基因组中有大量基因家族丢失和基因片段冗余。其中发生扩张的基因家族大部分参与能量采集、代谢和生长等过程，与作物产量相关。进一步，研究确定了小麦基因与特定性状之间的关联，这些都为加速栽培小麦育种提供遗传资源。

2013年3月，Nature，Triticum urartu，AA

中科院遗传与发育生物学研究所领衔完成了小麦A基因组的测序工作。小麦A基因组的祖先物种二倍体野生一粒小麦，即乌拉尔图小麦，经91X的 Illumina HiSeq 2000测序，组装得到Contig N50=3.42 kb，Scaffold N50=63.69 kb，基因组序列注释结果表明，66.88%的基因组为重复元件，同时发现一些重要农艺性状基因和分子标记。

2013年3月，Nature，Aegilops tauschii，DD

中国农业科学院作物科学研究所牵头完成对小麦D基因组测序，经90X不同插入片段的短读长测序，组装的Scaffolds覆盖了83.4%基因组信息，其中65.9%为转座子，经RNA-seq对确定了43,150编码蛋白基因，其中71.1%经遗传图谱锚定到染色体上。基因组组装注释分析，揭示了与抗病性、生物胁迫和籽粒品质相关的基因家族发生扩张。

2014年7月，Science，Triticum aestivum，AABBDD

中国农业科学院作物科学研究所牵头完成对小麦D基因组测序，经90X不同插入片段的短读长测序，组装的Scaffolds覆盖了83.4%基因组信息，其中65.9%为转座子，经RNA-seq对确定了43,150编码蛋白基因，其中71.1%经遗传图谱锚定到染色体上。基因组组装注释分析，揭示了与抗病性、生物胁迫和籽粒品质相关的基因家族发生扩张。

未来展望

依据测序技术不断发展，基因组的解析有了更多选择。在2017年PAG会议中，中国农业科学院作物科学研究所报道了最新的节节麦DD基因组进展，通过结合DeNovoMagicTM2 Nrgene，Illumina X10，PacBio和10xGenomics数据，组装结果不断提升。并通过Cytogenetic技术, CEGMA, BUSCO分析，与BAC序列比对评估组装结果，均表明组装结果有很大提升。

目前PacBioSMRT长读长测序技术是复杂基因组测序组装的利器，组学君认为这一优势将能在异源六倍体小麦基因组及二倍体四倍体小麦基因组的深入解密中发挥优势，填补基因组中gaps，挖掘更多小麦基因组家族中的“暗物质”。等待各位研究学者的持续解密！未来组愿助力各位在小麦及其他作物研究中的工作。

参考文献

1.Avni R, Nave M, Barad O, et al. Wild emmer genome architecture and diversity elucidate wheat evolution and domestication[J]. Science, 2017, 357(6346): 93-97.

2.Brenchley R, Spannagl M, Pfeifer M, et al.Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing[J].Nature, 2012, 491(7426): 705-710.

3.Ling H Q, Zhao S, Liu D, et al. Draft genome ofthe wheat A-genome progenitor Triticumurartu[J]. Nature, 2013, 496(7443): 87-90.

4.Jia J, Zhao S, Kong X, et al. Aegilops tauschii draft genome sequence reveals a gene repertoire for wheat adaptation[J]. Nature, 2013, 496(7443):91-95.

5.International Wheat Genome Sequencing Consortium. A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome[J]. Science,2014, 345(6194): 1251788.

6.Marcussen T, Sandve S R, Heier L, et al. Ancient hybridizations among the ancestral genomes of bread wheat[J]. Science, 2014,345(6194): 1250092.

7.Pfeifer M, Kugler K G, Sandve S R, et al. Genome interplay in the grain transcriptome of hexaploid bread wheat[J]. Science,2014, 345(6194): 1250091.

8.Choulet F, Alberti A, Theil S, et al. Structural and functional partitioning of bread wheat chromosome 3B[J]. Science, 2014,345(6194): 1249721.

近日~3.5Gb的向日葵基因组组装结果在线发表于Nature主刊，借助于高质量的基因组序列信息，结合重测序和转录组测序数据，研究者解析了向日葵的花期和产油量性状，重构菊类植物进化史，详情见下文分享。

向日葵在进化或植物发育的研究中都是非常重要的模式生物，然而由于其基因组相当复杂，含有大量高度相似的重复序列，导致其基因组组装充满挑战。此次项目中，研究者借助PacBio SMRT测序技术迎难而上，对向日葵自交系XRQ进行PacBio测序，综合407个Cells的测序数据，组装得到13,957个Contigs，结合高密度遗传图谱信息，将Contigs定位到染色体上，锚定了97%的序列信息。分析发现，其中有超过3/4的基因组序列是长末端重复反转录转座子LTR-RTs。

在获得向日葵高质量基因组序列信息后，研究者进一步分析向日葵特殊的进化地位及重要的农艺性状。

比较基因组研究

为评估菊类植物的演化史，研究者选择了菊类植物中的代表物种生菜、朝鲜蓟、咖啡和外群物种葡萄与向日葵基因组来进行比较分析。

分析发现向日葵，生菜，朝鲜蓟都经历了一次全基因组三倍化事件WGT，时间大概在38-50Ma，而向日葵的进化历史更加复杂，在29Ma前发生了特异性的全基因组复制WGD-2，加上17次染色体的裂变和126次染色体的融合，最终才形成向日葵现在的17条染色体组型（Fig.1）。

Fig.1菊类植物从AEKs的进化途径

向日葵农艺性状研究

在对向日葵两个重要育种性状，花期和油脂代谢的研究中，研究者通过整合旁系同源序列信息、转录组基因表达及重测序中的遗传变异信息确定了相关候选基因。

通过参考拟南芥基因网络，在向日葵基因组中确定了与花期相关的270个同源基因（Fig.2a）。接下来，研究者对来源于72个亲本材料的480个F1代杂交种进行了全基因组关联分析（GWAS）， 共定位了与花期相关的35个基因组区域。同时发现现代向日葵品种的花期调控基因在最近的全基因组复制过程中也发生了加倍，导致同一个花期基因在基因组中出现了两次（Fig.2b）。

Fig.2向日葵花期性状整合分析

a.向日葵花期调控基因网络关系

b.向日葵栽培品种的花期基因在染色体上的分布

在向日葵油脂性状研究中，研究者重构了向日葵油脂合成的代谢通路，确定了其中12个通路中429个候选基因（Fig.3a），同时，明确了32个基因区域的46个油脂代谢相关基因，与之前确定的QTLs相一致（Fig.3b）。其中，有9个油脂代谢相关基因在高油和低油品系中分化明显，分别在驯化后的育种过程中受到了人为选择。值得一提的是，其中PAP2基因家族的一个成员基因，前人研究发现该基因参与脂肪酸前体的合成，并能调控微藻的油脂含量，在本研究中发现该基因在种子里大量表达，且与种子的油脂含量密切相关。该基因可作为向日葵含量性状改良的重要候选基因（Fig.3f）。

Fig.3 向日葵油脂代谢整合分析
a.全基因组代谢网络 b.油脂代谢通路共表达通路 c.与QTLs共定位基因网络
d.甘油二酯和三酰甘油合成通路中基因 e.亚油酸脂合成通路中基因
f.参与脂肪酸前体合成的PAP2家族中候选基因的聚类树

向日葵高质量参考基因组的获得及相关遗传资源材料的丰富加强了以向日葵为模式的进化生态研究，同时，也加速了其育种进程，为基因组学研究提供了参考思路。

未来组作为三代测序基因组中心，已于2016年搭建了 Sequel、BioNano及Hi-C等技术平台。借助平台的搭建，未来组将会为更多合作伙伴提供专业优质的服务。

参考文献

BadouinH, Gouzy J, Grassa C J, et al. The sunflower genome provides insights into oil metabolism,flowering and Asterid evolution [J]. Nature. 2017.