Iso-Seq辅助揭秘紅葡萄之王 ——卡本內苏维浓的独特之处
卡本内苏维浓又名赤霞珠，是最为人熟知、原生于法国的酿酒葡萄品种，世界范围内分布广泛。早前的DNA分析认为卡本内苏维浓是黑葡萄卡本内弗朗（Cabernet Franc）和白葡萄品种白苏维浓（Sauvignon Blanc）二者的后代，果粒小、果皮厚、出汁量少，含有极高浓度的酚类物质和单宁，使得卡本内苏维浓葡萄酒拥有深邃神秘的酒色和涩感。
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PacBio 终于•也•升级了！软件、试剂双双升级，更高通量、更长读长！
PacBio公司在3月7日正式公开发布升级版PacBio Sequel软件（V5.1版本）和Polymerase试剂，Sequel平台测序通量和读长均得到极大提升。这一可喜的进步使得PacBio SMRT测序在de novo组装、结构变异检测、靶向测序以及RNA Iso-Seq测序等方面的应用更具优势。
【中国首次Nanopore Day】丨纳米孔测序大门为您打开
Oxford Nanopore官方计划在3月下旬在中国举办的首次Nanopore Day系列活动，未来组在此诚挚邀请您共同参加。
该系列活动由三场研讨会组成，跨越7天，分别在北京，上海和广州三地举办。每场研讨会为期一天，交流形式包括且不限于：
- 分享经验
- 介绍数据和网络
- 参与实际示范
现场除了Oxford Nanopore的员工会为您解答问题，未来组也将与您分享Nanopore组装经验、研发和应用进展。
在Nanopore Day北京会场（3月22日）与上海会场（3月26日），中国三代测序第一人–未来组&希望组CEO汪德鹏将与您分享我们基于Nanopore 技术在科研服务领域和医学应用方向的研究进展与展望。
| 区域 | 时间 |
| 北京 | 3月22日 |
| 上海 | 3月26日 |
| 广州 | 3月28日 |
关于Oxford Nanopore测序
原理简介
（a）motor蛋白牵引DNA至nanopore并解链
（b）DNA的单链通过纳米孔的时候，会对离子的流动造成阻碍。
（c）不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来。
应用
随着Nanopore技术的应用日渐成熟，通量和准确率得到极大提升，不断有研究者通过Nanopore数据进行从模式生物到更大基因组的组装，例如1 flowcell测拟南芥基因组[1]；1 flowcell测果蝇基因组[2]；~1Gb野生番茄基因组[3]和~3Gb人类基因组[4]等等。
不得不提其中在Nature Biotechnology 上发表的Nanopore超长读长组装人类基因组的研究论文，通过低覆盖深度测序（~30×普通nanopore reads+ ~5× ultra-long reads）即能将基因组Contig N50组装到6.4Mb，填补了参考基因组（GRCh38）中12个gap，是来自单一测序手段得到的迄今最连续的人类的基因组。
Nature Biotechnology丨Nanopore测序组装人类基因组
Nanopore技术不仅通过ultra-long reads 在基因组组装方面有优异的表现，还有另外一个全新突破：Direct RNA测序[5]。不经反转、无须扩增的RNA直接测序能获得全长的链特异性RNA，无测序偏好性，并同时记录碱基修饰，为后续研究基因结构和基因表达，提供新技术新方法。论文也以封面文章形式于2018年2月发表于Nature methods。
Nature methods丨基于Nanopore的direct RNA测序方法测评
未来组自2017年9月开始逐步搭建Nanopore测序平台，于2018年1月17日通过Oxford Nanopore Technologies Limited（牛津纳米孔技术有限公司，ONT）官方认证，获得Nanopore DNA测序认证服务供应商资质。
未来组迄今已完成数十个Nanopore动植物基因组测序组装，“百个Nanopore基因组计划”正如火如荼地进行；后续会陆续购入通量更高的PromethION测序仪，并与牛津纳米孔公司携手推出“1000个中国人基因组结构变异检测计划”，共同开发在生命科学领域的应用。
参考文献
[1] MICHAEL,Todd P., et al. High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell. Nature Communications, 2018, 9.1: 541.
[2] MILLER,Danny E., et al. High-quality genome assemblies of 15 Drosophila species generated using Nanopore sequencing.bioRxiv,2018, 267393.
[3] SCHMIDT,Maximilian H.-W., et al. De novo assembly of a new Solanum pennellii accession using nanopore sequencing. The Plant Cell, 2017, 29.10: 2336-2348.
[4] Jain M,Koren S, Miga KH, etal. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.Nature Biotechnology, 2018
[5] Garalde D R, Snell E A, Jachimowicz D, et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.Nature Methods,2018.
图片来源于网络｜侵删
未来组“高成长性企业”榜上有名
2018年3月7号生物办公布2017年度光谷生物城高成长性企业奖名单。继“瞪羚企业”后，武汉未来组再次荣耀上榜！
高成长性企业是指在较长时期(如5年至10年以上)内，发展速度快，能带来高效益，具有高增值能力，能引起当代生产领域的变革并处于当代经济前沿的企业。
武汉未来组作为第三代测序服务提供者，一直以“新技术，心服务”作为服务宗旨。公司成立7年来，每年保持3-5倍的高速增长。虽扎根武汉，但却面向全国，也积极走向世界。未来武汉未来组会继续在光谷生物城持续创新，致力于推动第三代测序技术在各个领域的深度应用。
武汉未来组是Oxford Nanopore官方认证测序服务供应商、是PacBio SMRT中国测序服务供应商、是BioNano 战略合作伙伴，拥有PacBio SMRT、OxfordNanopore、BioNano光学图谱及Hi-C染色体构象捕获等技术和平台，长期致力于三代测序在基因组学方向的深度挖掘和应用，解决了动植物基因组、微生物基因组、全长转录组及微生物群体研究等领域的技术瓶颈，推动了基因组学研究的升级换代。
未来组近年来的跨越式发展和高速成长，获得了业内高度认可，2017年年底入围中国光谷“瞪羚企业”，2018年初又入选光谷“高成长性企业”。武汉未来组会继续在光谷生物城持续创新，致力于推动第三代测序继续在各个领域的深度应用。
三篇全长转录组Iso-seq应用案例解析：动物、植物、微生物全覆盖
转录组学研究可以在整体水平上研究细胞中所有基因的表达调控规律，在分子水平上反映个体的生理生化过程。二代测序技术的应用使得人们得以初探转录组，但由于其短读长的技术限制，始终无法准确获得完整转录本。而三代长读长测序技术PacBio SMRT以其平均15~20kb的长读长优势，可以轻松覆盖转录本全长，使得人们终于可以窥得转录本全貌，为人们获取个体全长转录本并进行差异化分析、了解生命内在规律提供了新的解决方案。以下组学君为您带来三篇全长转录组Iso-seq应用案例解析，看看能不能为您带来新思路。
案例一
构建空心莲子草叶甲全长转录本集合[1]
Title：SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila
Journal：Science Reports（February 2018）
IF:4.259
空心莲子草是原产于南美的苋科植物，在十九世纪30年代进入中国并迅速成为入侵物种，对当地的生态系统造成了破坏。空心莲子草叶甲是空心莲子草的专性天敌，作为生物防治手段而被引入。研究者对其进行了全长转录组研究，获得较完整的转录本集合，为了进一步揭示空心莲子草叶甲与宿主植物和生态系统之间的互作关系打下基础。
材料与方法
物种：空心莲子草叶甲（Agasicles hygrophila）
取样：分别提取四个生长阶段（卵、幼虫、蛹、成虫）的RNA后混合测序
测序策略：PacBio SMRT
结果分析
文章应用部分篇幅阐述了PacBio SMRT Iso-Seq与RNA-Seq相比的长读长优势（Table 1）：通过Illumina测序获得的reads读长有70%分布在200-300bp，而PacBio SMRT则有超过69%的reads读长超过1kb。Iso-Seq共产生9.4Gb clean数据，158,085条FLNC reads。完整地读取转录本的全长，有助于更精准地进行转录本重构和基因注释。
Table 1 PacBio SMRT与Illumina测序结果比较
文章基于PacBio SMRT数据，做了进一步的全长转录组标准分析，重构了28,982 条转录本，预测了145个可变剪接事件；27,318条简单重复序列；经TransDecoder鉴定获得24,040个ORF，其中有16,205个完整的ORF；预测得到4,198个lncRNA。同时，研究者还用多个数据库对空心莲子草叶甲基因进行了注释。
该研究利用长读长测序手段首次完成对空心莲子草叶甲的转录本研究，4分SCI妥妥到手，同时也为后续进一步研究昆虫与宿主植物和生态系统之间的互作关系提供了很有价值的参考信息。
案例二
比较转录组学：自然选择的摩擦草属VS人工选择的玉米[2]
Title：Parallels between artificial selection in temperate maize and natural selection in the cold-adapted crop-wild relativeTripsacum
Journal：bioRxiv（September2017）
摩擦草属、玉米和墨西哥类蜀黍的亲缘关系很近，但摩擦草属对寒冷气候适应性更强。研究者利用三代Iso-seq获得摩擦草全长转录组，结合已发表的玉米参考基因组和蜀黍植物基因组数据，进行个性化比较分析，以期在不断变化的气候条件下，为人工培育农作物提供思路。
材料与方法
物种：摩擦草（Tripsacum）
取样：提取野生摩擦禾种子发芽生长的单一植株的根、叶和茎RNA后混样测序
测序策略：PacBio RSII
结果分析
选取摩擦草属和玉蜀黎属为目标物种，高粱属、狗尾草属、复活草属为背景物种，稻属、短柄草属为外参物种，构建系统进化树。发现摩擦草属和玉蜀黎属中的6,950个直系同源基因在七种草类物种共有，包括4,162个一对一，1,436个一对二和1,352个二对二直系同源基因集，说明玉米和摩擦禾可能拥有相同的全基因组复制情况，二者的亲缘关系很近。
Fig.1 系统进化树
利用PacBio Iso-seq测序技术获得摩擦草的全长转录组与玉米参考基因组(RefGen v3)进行比较分析，发现玉米转录组中包含更多的可变剪切事件，且在玉米和摩擦禾的直系同源基因中发现有超过2/3(656, 61.6%)的保守基因发生可变剪切，而409个基因是玉蜀黍属-摩擦草属所特有的；在摩擦草中发现249个lncRNA，平均长度1.45kb,比玉米用PacBio Iso-seq技术测得的lncRNA的平均长度（0.67kb）长，且仅有17个lncRNA与玉米表现为高度一致性。
Fig.2 (a)摩擦草和玉米之间Ka / Ks比值的分布散点图; (b)摩擦草中磷脂代谢基因与其他功能基因的Ka / Ks比值分布图
脂质具有防止细胞膜在低温条件下损伤的作用，因此膜脂质组成的变化可能是与摩擦草的耐冷性相关。研究者比较玉米和摩擦禾中相同基因之间的Ka / Ks值，发现磷脂生物合成途径中的基因显示比背景基因更高的Ka / Ks比值，说明参与磷脂代谢的基因加速了物种的进化过程（Fig.2）。研究指出摩擦草中参与磷脂代谢的相关基因中的蛋白质序列的加速进化可能是造成摩擦草属相对于玉米更耐寒的原因。
案例三
动态转录组监控裂殖酵母减数分裂过程中Isoform水平的多样性[3]
Title:The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms
Journal：GenomeResearch（January 2017）
IF：11.922
可变剪接增加了后生动物转录组和蛋白质组多样性，但人们对于单细胞生物的可变剪接事件还知之甚少。研究者以裂殖酵母为模型，利用三代长读长测序技术的同时开发了SpliceHunter软件用以对其进行转录组的可变剪接事件进行动态分析。
材料与方法
物种：裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
取样：在0-10h内间隔2h取样，分别提取RNA测序
测序策略：PacBio RSII
结果分析
从PacBio测序获得的Iso-seq reads 平均长度为1178 bp，共发现了S. pombe中~90%（6,199个）的基因。研究者发现在裂殖酵母的减数分裂时期，发现17,669个异构体，发生了14,353个可变剪切事件，其中，内含子保留是最主要的可变剪接形式（Fig. 3）。研究反映了裂殖酵母S. pombe转录本的复杂性：~1300个基因发生了一次可变剪接，1432个基因发生了两次可变剪接，而发生了2次以上的可变剪接事件的基因超过3000个。
Fig.3 S. pombe中的可变剪接事件
Fig. 4 减数分裂期间不同可变剪接形式的变化趋势
研究发现在裂殖酵母减数分裂期间，大部分的可变剪接类型都有所增加，仅有外显子跳跃类型的可变剪接在减数分裂初期处于低水平而在减数分裂末期有所增加（Fig.4）。这种变化反映了S. pombe在有丝分裂和减数分裂期间的一种条件驱动的可变剪接机制。研究结果反映了裂殖酵母性发育过程中Isoform水平的多样性和动态变化。
由此可见，基于三代长读长测序的Iso-seq技术跨越了传统测序技术无法克服的鸿沟，极大地丰富了对转录本结构的研究，可准确辨别二代测序无法识别的异构体（Isoform）、融合基因、lncRNA等，获得更加全面的注释信息。
未来组的全长转录组学研究，不仅包含PacBio SMRT技术，也已推出基于Nanopore的direct RNA测序技术，开启转录组学研究新纪元，我们有丰富的全长转录组项目经验，针对特定项目，对分析流程进行优化，以期为不同领域的研究者提供更为完善的解决方案。
参考文献
[1]Jia D, Wang Y, Liu Y, et al. SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 2197.
[2] Yan L, Lai X, Rodriguez O, et al. Parallels between artificial selection in temperate maize and natural selection in the cold-adapted crop-wild relativeTripsacum[J].bioRxiv, 2017: 187575.
[3]Kuang Z, Boeke J D, Canzar S. The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms[J]. Genome research, 2017, 27(1): 145-156.
延伸阅读
近期两篇Nanopore组装果蝇基因组文章预印，低于＄1,000 价格又搞定一个模式生物
2018年2月18日，bioRxiv同时预印两篇使用Oxford Nanopore测序组装果蝇基因组的论文，两个不同机构的研究人员不约而同选择了时下最热门的纳米孔测序手段来获得果蝇的基因组，侧面反映出大家对这个技术的关注是so hot~。如果您也有意尝鲜组学新技术，当然请联系未来组。
以下是两篇文献的简单介绍
论文一 一种黑腹果蝇基因组组装
研究中使用黑腹果蝇D. melanogaster (ISO1)基因组DNA在Oxford Nanopore MinION掌上测序仪上测序1个 flowcell，以其中长度在1kb以上的reads（约30×的测序深度）与二代数据结合进行混合组装，加上Bionano光学图谱数据辅助scaffolding，获得高准确度、高连续度和高完整度的基因组组装结果：Contig N50:18.9Mb，BUSCO评估97.1%。
通过与参考基因组进行比较，揭示了大量结构变异，包括与发育、行为、代谢基因相关的novel LTR转座元件的插入和复制等，这些结构变异有助于研究后生动物基因组进化。
文中提到完成该基因组的费用不超过$1,000。
参考文献
SOLARES,Edwin A., et al. Rapid low-cost assembly of the Drosophila melanogasterreference genome using low-coverage, long-read sequencing. bioRxiv,2018, 267401.
论文二 15种不同的果蝇基因组组装
研究对果蝇属的15种果蝇进行了平均深度29×的Nanopore测序，使用minimap2 和miniasm快速组装，平均Contig N50: 4.4Mb。经过自身校正和二代校正后，BUSCO评估数值平均为97.7%。
通过与这些果蝇以往参考基因组对比，结果表明，平均填补了参考基因组中约60%的gap（Table 2）说明长读长测序数据的引入，有助于提高基因组组装的连续度和完整度。Fig.1 以D. erecta参考基因组中Scaffold_4845和本研究中对应的Contig（utg0000101）对比为例，展示了以Nanopore数据组装获得的一个17.4Mb的contig（utg0000101）填补了参考基因组中由38个contigs组成的Scaffold 4845中的gaps，解析了3.7 Mb参考基因组中的未知序列。
Fig.1参考基因组中的gaps能被长读长测序数据填补
文中也提到，每个基因组的费用都未超过$1,000。
参考文献：
MILLER,Danny E., et al. High-quality genome assemblies of 15 Drosophila speciesgenerated using Nanopore sequencing. bioRxiv,2018, 267393.
长读长Nanopore测序数据的引入能明显增强基因组组装的连续性和完整度，为进一步深入研究种群结构遗传变异的进化和功能打开了一扇门。Nanopore 更高通量的新款测序仪PromethION已经上市，每个Run理论产出6.2TB，未来单GB数据价格会进一步下降，敬请持续关注。
未来组于2017年引进Oxford Nanopore平台，在2018年初率先获得Oxford Nanopore测序认证服务供应商资质认证。未来组将持续扩大Oxford Nanopore测序平台，打造包含三代单分子测序、光学图谱、三维基因组学等多方位的组学研究中心，还将在RNA直接测序、表观转录组学等领域进行深度的探索。
组学新技术尝鲜当然要找未来组
延伸阅读
里程碑丨Nanopore测序组装人类基因组终见刊NBT，牛津纳米孔公司携手未来组推“1000个中国人基因组结构变异检测计划”
比较基因组学研究揭示萤火虫荧光素酶基因的起源与进化
为了揭示萤火虫荧光素酶基因的遗传基础及其起源、进化过程，Timothy R. Fallon等人用PacBio+Illumina+Hi-C多技术结合的策略组装出了高质量的北斗七星萤火虫（Photinus
pyralis，Lampyrinae亚科）基因组，解决了其中与荧光素酶基因相关的串联重复序列。同时，研究者还对日本萤火虫（Aquatica lateralis，Luciolinae亚科）和发光磕头虫（Ignelater luminosus，叩甲科）进行Illlmina基因组测序并完成组装。通过对这三个荧光甲虫进行比较基因组学和转录组分析，对发光甲虫的发光和化学防御机制在近1亿年来的进化历程提出了新的见解。
基因组组装结果
研究者对三种物种分别运用了不同的策略进行基因组组装，结果见Table 1。北斗七星萤火虫因引入三代长读长测序数据及Hi-C辅助组装，ScaffoldN50高达50Mb，还组装出了富
含~1kb串联重复序列（TRU）的线粒体基因组(Fig.1a)。
BUSCO评估显示这三个基因组的组装完整度均超过了93%，高质量的基因组为后续的生物发光研究提供了有价值的参考信息。
Table 1北斗七星萤火虫、日本萤火虫和发光磕头虫的基因组组装结果比较
Fig.1 北斗七星萤火虫线粒体基因组示意图（a）；北斗七星萤火虫、日本萤火虫、发光磕头虫和黑腹果蝇基因维恩图（b）
经注释，发现北斗七星萤火虫、日本萤火虫和发光磕头虫中的编码基因分别有15,770, 14,285和27,552个，经Orthofinder pipeline分析发现北斗七星萤火虫和日本萤火虫的基因具有很大的相似性，而发光磕头虫则大不相同（Fig.1b）。
荧光素酶基因的进化历程
萤火虫的荧光来自于其体内的一系列化学反应：小分子基质荧光素在有O2、Mg2+和ATP存在的条件下，被荧光素酶催化形成脱羧产物氧化荧光素，从而发光。研究者推测萤火虫的荧光素酶基因是由一个祖先基因——过氧化物脂肪酰基辅酶A合成酶基因（PACS）进化而来，
因为它和与它密切相关的非生物发光的旁系同源基因都具有脂肪酰基辅酶A的合成活性（Fig.2）。叩甲科和萤科的荧光素酶属于同一蛋白超家族，且它们的发光机制及荧光素的化学性质都相同，说明这两科的荧光素酶基因应该是同一起源，与以往系统发育学研究中关于这两个家族的的荧光素酶基因是独立起源的假说不同。
Fig.2荧光素酶的催化机制与脂肪酰基辅酶A合成酶的催化机制相关
通过对基因结构进行比较，研究者发现北斗七星萤火虫和日本萤火虫中都存在Luc1和Luc2这两个荧光素酶基因，其中Luc1是萤火虫的一个直系同源基因，位于一簇过氧化物脂肪酰基辅酶A合成酶（PACS）和非过氧化物脂肪酰基辅酶A合成酶（ACS）基因当中，广泛存在于多种萤火虫基因组；以往研究认为旁系同源基因Luc2仅存在于少数包括日本萤火虫在内的亚洲类群当中，而本研究的基因组组装分析结果显示：在北斗七星萤火虫和日本萤火虫这两类萤火虫基因组中，Luc1和Luc2这两个荧光素酶基因都存在且位于不同的染色体上。
萤火虫的荧光素酶基因及与其密切相关的旁系同源基因的基因结构普遍含有串联重复序列。荧光素酶基因Luc1和Luc2在基因结构上都比较保守，由七个保守的外显子构成。萤光素酶、
PACS和ACS的系统发育分析表明，Luc1和Luc2代表两个密切相关的直系同源基因，并且与Luc1邻近的PACS和ACS是共直系同源的，虽然共线性关系不太清楚，这可能是由后来的基因重排造成的（Fig.3）。
Fig.3荧光素酶基因共线性分析
数据说明串联基因的复制产生了PACS的几个旁系同源基因，其中一个新功能化成为萤光素酶祖先基因（AncLuc）。AncLuc原位产生了Luc1，而Luc2则可能是在1亿年前AncLuc发生了远程基因复制事件形成的；随后发生基因重排从而产生了萤火虫的两个亚科 ——Lampyrinae亚科和Luciolinae亚科。基于以上推测，研究人员绘制了萤火虫荧光素酶基因进化模型（Fig.4）。
Fig.4 萤火虫荧光素酶基因进化模型
此外，研究者还利用RNA-Seq技术对三种发光甲虫不同性别、不同组织部位、不同发育时期的基因表达进行了解析，分析了在荧光素酶代谢过程中起关键作用的基因。
DNA测序技术及生物信息技术的发展为物种的起源和进化研究提供了有力的科学依据。本研究提供了一个适用于大多数物种的基因组测序组装策略，利用二代短读长测序数据结合三代PacBio长读长测序数据，并使用其他大片段技术（如Hi-C等）辅助，可以组装出跨越串联重复序列、端粒、着丝粒等特殊区域的高质量基因组。获得高质量的参考基因组将会极大的延展研究者对研究对象的遗传多样性上的认识，进一步揭示物种之间的进化关系。
参考文献：
Fallon T R, Lower SE, Chang C H, et al. Firefly genomes illuminate the origin and evolution of bioluminescence[J]. bioRxiv, 2017: 237586.
图片来源于网络｜侵删
2017农历年前，Nanopore组装动植物基因组盘点
Oxford Nanopore Technology（ONT）的概念从上个世纪80年代就提出来，但从理论到商业化应用，走了二十多年。2014年，ONT对外提供MinION试用项目计划（MAP），随后几年不断对早期版本仪器的高错误率和低通量问题进行改善。从2016年开始，Nanopore平台通量得到较大提升，错误率也显著降低，在基因组中的应用已从小基因组逐渐延伸到复杂动植物基因组中的应用，而更高通量平台GridION X5 和PromethION的发布将对Nanopore在复杂物种中的应用更为简单和便捷。
高质量的参考基因组是深入进行物种起源进化和基因功能研究的前提，利用Nanopore长读长测序技术，读长最高可达>1Mb，克服高杂合、高重复、多倍体等组装难题，有助于获得更完整、更连续的参考基因组。近两年已有数篇基于Nanopore数据的基因组文章发表，请听组学君娓娓道来。
NBT丨~30×普通reads+5×ultra long reads组装人类基因组，NG50: ~6.4 Mb[1]
文章在2017年4月预印，2018年1月29日正式发表于Nature Biotechnology。研究结果显示：低覆盖深度测序（~30×普通nanopore reads+ ~5× ultra-long reads）即能将基因组Contig N50组装到6.4Mb，填补了参考基因组（GRCh38）中12个gap，是来自单一测序手段得到的迄今最连续的人类的基因组。
NC丨单个Nanopore flowcell数据组装拟南芥基因组，N50高达12Mb[2]
文章在2017年6月预印，2018年2月正式发表于Nature Communications。文中使用便携式U盘大小Nanopore MinIon对拟南芥(KBS-Mac-74 accession)测序1 flow cell，使用家用电脑水平的硬件（4核，16Gb RAM），耗时4d完成组装。
随着测序仪价格平民化，旧时王谢堂前燕，已飞入寻常百姓家。日后随着测序成本进一步下降，即使仅为了解基因组单个区域的复杂结构变异，组装完整的基因组也将成为实现这一目标的最简单的方法。
PC丨第一个正式发表的Nanopore大型植物基因组，野生番茄[3]
2017年10月，野生番茄（Solanum pennellii）基因组文章发表于The Plant Cell。31个MinION flowcell测序，通过Canu-SMARTdenovo组装，得到了高质量的番茄基因组。Contig N50 达2.45 Mb，经Nanopolish及pilon迭代校正后，碱基错误率<0.02%，基因组完整性评估96.53%。
研究者最后粗略估算了下成本，对于这种中等大小的植物基因组（<2Gb）的Nanopore测序，在当时当地情况下，项目预算低于$25000，其他开销主要是计算资源，人力成本和耗损等。另一方面，Nanopore测序下机数据含有CpG甲基化数据信息，在不需要增加成本的情况下，可利用甲基化信息对物种进行深层次的表观关联研究。
Genome Research丨秀丽隐线虫基因组[4]
文章于2017年1月预印，2018年2月正式发表于Genome Research。文中借助Oxford Nanopore测序技术对秀丽隐杆线虫的两个品型（野生型；带有两个复杂染色体重排区域的突变型）进行了全基因组测序，通过~60×Nanopore数据，组装出野生型秀丽隐杆线虫基因组（仅由48个contig组成，N50达3.99Mb，覆盖了参考基因组>99%的区域），完善了秀丽隐杆线虫参考基因组，并基于高质量的参考基因组研究突变型中复杂的重排机制。
BMC Biology丨巴西日圆线虫基因组[5]
文章2018年1月发表于BMC Biology，研究者以巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）为材料，采用目前读长最长的Oxford Nanopore测序技术，对其基因组进行de novo组装，并加入二代参考基因组进行比较，结果显示：基于长读长的基因组组装，能更好地覆盖串联重复等复杂区域。
目前正式发表的纯Nanopore de novo组装动植物基因组就是这5篇文章[1-5]，另外还有Nanopore+Illumina混合组装案例，墨瑞鳕鱼、欧洲鳗、耐盐水稻、小丑鱼，请见如下汇总表[6-9]。文献下载请见文末。
随着高分文章的发表，Nanopore技术的应用日渐成熟，并被广泛认可。Oxford Nanopore公司也在改进其价格、准确度、读长、产量、便携性等方面持续发力，比如即将推出的更高通量的PromethION测序仪，拥有3000个通道和单个flow cell 120G的产量，48h内产量可达6.2T，为更大规模更复杂物种的基因组快速测序提供了可能。而产量的提高必然会带来价格的下降，也将会促进各个方面应用，除了动植物基因组de novo测序，2018年Nanopore还将会在重测序、结构变异检测、目标区域捕获测序、全长16s测序、宏基因组测序、甲基化测序等领域升级应用，尤其是转录组研究领域，direct RNA sequencing将会有一波新的应用场景。另外直接蛋白质测序，也是非常值得期待的亮点之一。在提高测序读长和碱基准确度方面也在持续改善，1D2文库搭载R9.5芯片，可使单碱基原始准确率提高到95%左右；ultra long 建库方式，可获得N50接近100k，最长超过1M的Reads。这使得动植物基因组完成图，多倍体物种单倍体分型等不再遥远。
参考文献
[1] Jain M,Koren S, Miga KH, etal. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads.Nature Biotechnology, 2018
[2] MICHAEL,Todd P., et al. High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell. Nature Communications, 2018, 9.1: 541.
[3] SCHMIDT,Maximilian H.-W., et al. De novo assembly of a new Solanum pennellii accession using nanopore sequencing. The Plant Cell, 2017, 29.10: 2336-2348.
[4] TYSON, JohnR., et al. MinION-based long-read sequencing and assembly extends the Caenorhabditis elegans reference genome. Genome research, 2018, 28.2: 266-274.
[5] ECCLES,David, et al. De novo assembly of the complex genome of Nippostrongylus brasiliensis using MinION long reads. BMC biology, 2018, 16.1: 6.
[6] AUSTIN,Christopher M., et al. De novo genome assembly and annotation of Australia’s largest freshwater fish, the Murray cod (Maccullochella peelii), from Illumina and Nanopore sequencing read. GigaScience, 2017, 6.8: 1-6.
[7] JANSEN,Hans J., et al. Rapid de novo assembly of the European eel genome from nanopore sequencing reads. Scientific Reports, 2017, 7.1: 7213.
[8] MONDAL,Tapan Kumar, et al. First de novo draft genome sequence of Oryza coarctata, theonly halophytic species in the genus Oryza. F1000 Research, 2017, 6.
[9] TAN, MunHua, et al. Finding Nemo: Hybrid assembly with Oxford Nanopore and Illumina reads greatly improves the Clownfish (Amphiprion ocellaris) genome assembly.GigaScience, 2018.
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强强联手：昆明动物所携手武汉未来组，共同推进中外基因组学信息交流
2018年伊始，未来组与中国科学院昆明动物所遗传资源与进化国家重点实验室达成长期学术交流合作协议，独家冠名赞助该国重2018年“遗传与进化交叉论坛”等一系列学术会议，共同推动中外动物基因组学信息流通，交流合作。
上周，“未来组”遗传与进化交叉论坛2018年第一场报告会在中国科学院昆明动物所西南多样性实验室报告厅成功举办。论坛有幸邀请到重点实验室学术委员会委员桂建芳院士及杨光教授做学术报告，为本论坛拉开帷幕。重点实验室学术委员会委员张克勤教授、昆明动物研究所姚永刚所长、赖仞副所长、重点实验室施鹏主任、毛炳宇副主任等PI以及研究所100余位师生聆听了报告并进行学术交流，论坛由重点实验室副主任焦保卫研究员主持。
报告前，焦保卫研究员简要介绍启动“未来组”遗传与进化交叉论坛的目的、分类等背景情况。桂建芳院士的报告以“从单性生殖银鲫雄性发生与决定机制的发现谈脊椎动物性别演化的多样性与可塑性”为题，完整的呈现了他20多年连续的研究成果。杨光教授以“适应进化驱动鲸类物种形成”为题，分析江豚物种形成时间，并评估其历史种群动态。
关于中国科学院昆明动物所遗传资源与进化国家重点实验室
立足于我国西南和东南亚丰富的生物多样性遗传资源，面向战略生物资源的国家需求和世界科技前沿，在遗传资源多样性的演化与保护、基因与基因组的进化、遗传发育与进化三个重点研究方向上打下坚实的基础。
关于武汉未来组
拥有PacBio SMRT、Oxford Nanopore、BioNano光学图谱及Hi-C染色体构象捕获等技术和平台，长期致力于三代测序在基因组学方向的深度挖掘和应用，解决了动植物基因组、微生物基因组、全长转录组及微生物群体研究等领域的技术瓶颈，推动了基因组学研究的升级换代。
重点实验室与未来组的合作共同致力于突破技术研究瓶颈，推动科技的发展。本次合作是智慧与技术的结合、科技与成果的桥梁。未来组期待与更多伙伴进行多元化的深层次合作交流。
Nanopore测序揭露线虫基因组中复杂串联重复序列
真核生物的基因组组装一直是个难题，而线虫基因组更是含有大量的卫星DNA等重复序列，短读长的测序手段往往对此束手无策。而三代长读长测序技术的发展为复杂基因组研究带来了希望。
研究者以巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）为例，采用目前读长最长的Oxford Nanopore测序技术，对其基因组进行de novo组装，并加入二代参考基因组进行比较，结果显示：基于长读长的基因组组装，能更好地覆盖串联重复等复杂区域。
材料和方法
材料：巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）
测序平台：Oxford Nanopore MinION
（未来组配备Nanopore升级平台GridION X5，实时base calling，通量更大，效率更高）
比较结果
1.基因组组装
与以往WTSI的二代参考基因组比较，组装指标大幅度提升(Contig N50: 33.5Kb→209.2Kb)。
Table 1组装结果比较
2.组装评估
经不同方法校正后的BUSCO值比较，表明经三代Nanopolish自我校正后，MinION reads的组装质量优于WTSI参考基因组。
Table 2 不同方法校正后的BUSCO值比较
3.对串联重复序列的识别
由于Nanopore长读长测序能有更好的overlap关系，有助于识别复杂的重复单元。例如，本研究组装出的线虫基因组中，检测到一个由171bp的重复单元构成的21kb的串联重复序列的存在，但在二代参考基因组中未能识别出来（Fig.1）。
Fig.1一个74kb的MinION read与WTSI参考序列的比对(a)；MinION read鉴定出WTSI参考序列中存在一个复杂串联重复序列（b）
与二代参考序列相比，Nanopore组装能更好地反映N. brasiliensis基因组中重复序列的多样性（Fig.2）。
Fig.2 WTSI二代参考序列中的重复序列分析（a）；
Nanopore组装中的重复序列分析（b）
二代短读长测序技术在富含大量重复片段的基因组测序中存在不足，而三代长读长测序是解决含复杂重复串联序列基因组的一大利器。在本研究中，研究者通过应用单纯的MinION data，辅以改良的Base-calling算法Albacore和升级的Canu v1.5组装手段得到了不逊色于Illumina的线虫基因组。
参考文献
David Eccles, Jodie Chandler, Mali Camberis, etal. De novo assembly of the complex genome of Nippostrongylus brasiliensis using MinION long reads[J]. BMC Biology, 2018, 16(1):6.
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