种子植物包括裸子植物（gymnosperms）和被子植物（angiosperms），裸子植物分为四大类，即苏铁类（cycads）、银杏类（Ginkgo）、松柏类（conifers）和买麻藤类（gnetophytes）。裸子植物基因组较大，重复序列含量高，结构复杂，迄今为止，现存最原始种子植物苏铁分支尚缺少完整的基因组图谱。

2022年4月18日，由22个机构65位科学家联合在Nature Plants发表了题为“The Cycas genome and the early evolution of seed plants”的封面文章，报道了现存最原始种子植物苏铁参考基因组，填补了种子植物基因组研究的空白。苏铁基因组的发布，代表着种子植物基因组演化研究中的最后一块拼图完成，为后续比较基因组学的开展奠定了基础。希望组参与了本研究项目中攀枝花苏铁的测序、组装及初步注释服务。

苏铁基因组测序材料选取苏铁类的基部类群、也是整个苏铁类分布纬度最北的种类攀枝花苏铁（Cycas panzhihuaensis）。基于长片段测序与MGI-SEQ测序，苏铁基因组组装大小为10.5 Gb，contig N50为12Mb，结合Hi-C数据，挂载为11条染色体。其中共注释32,353个蛋白编码基因，BUSCO评估完整度为91.6%，是目前裸子植物中最高质量的大基因组图谱。

裸子植物具有4大分支，1118种，关于裸子植物内部大分支之间的系统演化关系一直有不同的学术观点。基于15个维管植物基因组3282个直系同源低拷贝核基因、90个种子植物转录组1569个直系同源基因、72种维管植物叶绿体和线粒体基因组数据的系统分析结果表明，苏铁单独（线粒体数据）、或和银杏一起（核基因、叶绿体数据）构成其它所有裸子植物的姐妹群。

基因组加倍是植物演化适应的重要驱动力，关于裸子植物共同祖先是否经历了全基因组加倍事件一直存在争议。研究者采用对重复基因同义替代分析和系统发育基因组学方法，并使用基因组内共线性区域进行比较验证，发现现存裸子植物的最近共同祖先可能经历了一次古老的全基因组复制事件（命名为ω，图一a）。伴随着种子植物起源，许多关键创新性状如种子发育、花粉、次生生长相关的基因家族均发生了创新或扩张。在种子植物的祖先节点共发现663个新获得的基因家族和368个扩张的基因家族。其中，106个新获得和55个显著扩张的基因家族与种子生理发育有关，包括调控胚胎早期发育、种子休眠和萌发、种子能量和营养代谢，种皮形成以及种子的免疫和应激反应等（图一b）。

图一、a) 基于系统发育关系推断种子植物的全基因组加倍事件；b) 种子植物的基因家族创新和扩张。

最显著扩张的种子生理相关家族是cupin蛋白家族。攀枝花苏铁编码一类新的vicilin-like贮藏蛋白 vicilin-like antimicrobial peptides（v-AMP），在基因组中呈串联基因阵列分布，多在授粉胚珠后期和受精胚珠时期表达，而后逐渐降低，暗示v-AMP基因在种子发育过程特定时期发挥重要作用。LAFL家族（LEC1、ABI3、LEC2和FUS3）是种子发育核心调控基因，苏铁等裸子植物的FUS3和LEC2基因可构成一个新的进化枝，定义为FUS3 / LEC2-like类型，与被子植物的FUS3和LEC2形成姐妹分支关系。FUS3 / LEC2-like类别是裸子植物特有的。在攀枝花苏铁授粉后，其会表现出明显的表达，表明可能在裸子植物胚胎发生早期发挥特定作用 。

苏铁类起源于古生代二叠纪早期，距今已有至少2亿7千万年历史。在经历大量灭绝以后，现代苏铁多是近期几次辐射演化的后代。如今苏铁具有2科10属。研究者基于现存苏铁目339种植物的转录组数据，重建了苏铁类自身的系统发育关系。分子钟分析表明，现存苏铁的多样化同步发生于距今1100至2000万年之间，是中新世以来气候剧烈变化的结果（图二）。

图二、苏铁目系统发育树支持现存苏铁是辐射演化的结果

雌雄性别分化是一种进化性状。裸子植物已报道的1118个物种中，65%的种类都是雌雄异株， 而在被子植物中雌雄异株只占到6%。苏铁类植物均为雌雄异株（图三），由于其生长缓慢，以往只能在开花时才能判断性别，而成株树龄多在十年以上以及在适宜的环境才会开花。研究苏铁性别决定的分子机制，可以在植株进入花期前就确定性别，对于苏铁类植物的就地和迁地保护和园林培育具有重要意义。苏铁的性别控制基因一直困扰科学界。研究者通过对源于四川攀枝花苏铁国家级保护区62株雌雄苏铁群体测序，表达差异分析，和雄性Y染色体的组装，找到雌雄表达差异最大的一个基因来自雄株的Y染色体，该基因编码一个MADS-box转录因子，推测其调控雌雄苏铁的性器官发育，揭示了苏铁性别决定的遗传机制。该转录因子的同源基因也仅能在雄株基因组中检测到，说明了该性别决定机制在苏铁类植物中的保守性。

图三、a) 攀枝花苏铁；b) 攀枝花苏铁雄株和雌株的孢子体。

 图四、a)苏铁水平转移毒蛋白基因的演化历史。b-f) 苏铁毒蛋白基因表达，及对昆虫毒性实验。

该研究由深圳华大生命科学研究院、深圳市仙湖植物园、中国科学院昆明植物研究所、兰州大学、中国环境科学研究院、河南大学和南京林业大学等22个机构65位科学家联合完成。该论文第一作者为深圳华大生命科学研究院刘阳、王思博、李林洲、杨婷、魏桐，深圳仙湖植物园董珊珊，兰州大学武生聃等为共同第一作者，分别在基因组不同的领域贡献了自己的专业力量。深圳仙湖植物园张寿洲，深圳华大生命科学研究院刘欢，中科院昆明植物所龚洵，美国佛罗里达大学Douglas E. Soltis，比利时根特大学Yves Van de Peer为文章共同通讯作者。该项目得到深圳市城市管理和执法局科研专项、国家重点研发计划、生态环境部生物多样性调查与评估等基金支持。

自T2T联盟于2021年5月在BioRixv预印版上发表了首个人类基因组完成图及相关文章之后，近日人类泛参考基因组联盟紧跟步伐在BioRixv预印版上发布了题为“Automated assembly of high-quality diploid human reference genomes”的文章。

样本来源

目前常用的人类参考基因组GRCh38，是科研团队花费20多年的努力而完成的高质量的人类基因组。该基因组极大程度上推进了生命科学相关领域的发展。但是它仍然存在着许多gaps（gap数已从原来的150,000个降低至了现今的995个）和错误。因为GRCh38是20位匿名志愿者的混合样本，所以并不代表单个个体的人类基因组。2021年，T2T联盟利用最新的长读长技术与自主研发的生信算法组装出了高质量端粒到端粒的参考基因组CHM13（首个人类基因组完成图）。由于它来源于一个带有重复基因的葡萄胎细胞系，因而几乎是纯合基因组。在组装难度上，纯合基因组比二倍体基因组组装相对较低。为了解决这些原有人类基因组序列的局限性，研究团队成立了人类泛参考基因组联盟（Human Pangenome Reference Consortium，HPRC）。该联盟旨在整合高质量、低成本、二倍体人类基因组，用以构建代表人类遗传多样性的人类泛参考基因组。

人类泛参考基因组联盟使用的是二倍体基因组，组装难度会更高。在样本选择上，选择了广泛使用的HG002的永生化淋巴细胞GM24385，用于ONT测序和Bionano光学图谱测序。二代illumina测序和PB测序数据使用的样本是由大量GM24385细胞而来的NIST标准样本8391 DNA样本。父系样本HG003和母系样本HG004分别来源于公开的GM24149和GM14143细胞系，并通过二代illumina测序对NIST标准样本8392（含HG002、HG003和HG004）的DNA进行测序。

组装策略及结果

本文是以HPRC的名义发表的首篇文章，该文章确定了当前基因组测序和automated组装方法的组合可以在人工干预最少的情况下产生最完整、最准确和最经济的二倍体基因组组装。在组装过程中，团队选择了最优的高精度长读长reads和父母本及子代数据进行单倍体分型组装（trio-based assembles）的方法。第一个高质量二倍体人类参考基因组（XY型），平均每条染色体仅有~4个Gaps（范围在0-12），大多数染色体长度和CHM13相比仅有±1%的差异。将近四分之一的蛋白编码基因在单倍型间存在同义氨基酸变化，而其中着丝粒区域变异的密集度最高。该研究为构建涵盖从单个核苷酸到大型结构重排的所有遗传变异的人类泛参考基因组奠定了基础。

测序及组装方法的测试总结

HPRC Trio pipeline v1.0组装流程图

小结

使用目前已有的方法和技术，研究者们可将二倍体HG002基因组的组装达到整体完整度的98.5%。利用这些方法组装不同的二倍体人类基因组，构建人类泛参考基因组，将会更全面地了解人类遗传多样性，提高精准医疗的准确性，并对生物基因组学有更深入的了解。

美国学者Erich D. Jarvis为论文的第一作者，中南大学王建新团队、中山医眼科肖传乐团队、中国农科院阮珏团队、昆明动物所张国捷团队以及华大基因杨琛涛团队均参与该项项目研究。

希望组一直致力于推动各个物种基因组完成图的组装及应用。近期还为动植物基因组完成组量身定制包含测序及组装在内的全套解决方案，敬请期待！

原文链接：https://doi.org/10.1101/2022.03.06.483034

2021年ONT在科研团体大会（Nanopore Community Meeting）上发布了”Q20+”试剂产品。这是利用包含最新“Q20+”化学试剂并支持“双链”（Duplex）测序的新试剂盒LSK112和最新芯片R10.4相结合的测序技术，可以实现＞99%的原始reads（单链）准确度，或约Q30的双链（Duplex）准确度。

希望组（GrandOmics）作为中国最早开展ONT测序服务的公司之一，一直走在技术应用的前沿，率先将高通量单细胞分选平台10X和ONT最新技术进行组合创新，给火热的单细胞测序领域，提供了全新的技术解决方案。

测试背景

2020年8月于Nature Communication杂志发表的题为“High throughput, error corrected Nanopore single cell transcriptome sequencing”的研究论文，将单细胞与Nanopore全长转录组进行了技术整合，使得在单细胞水平上检测差异RNA剪接和RNA编辑成为可能。利用Illumina对10X Genomics文库进行短读长测序，为每个基因和基因组区域定义相关的Cell Barcode，随后为每个细胞、基因或基因组区域定义相关的UMIs组合。进而利用上述信息指导Cell Barcode和UMI分配到已比对至基因组上的Nanopore reads，通过对相同UMI的reads进行分组，校正和拆分Nanopore测序reads，用于开展下游的isform分析和RNA编辑。考虑到ONT-Q20+测序即将成为行业新的长读长测序技术标准，我们迫不及待的进行了新的尝试。

测试方式

10X单细胞平台获得的全长cDNA分成两份，一份进行常规二代测序，另外一份进ONT Q20+R10.4测序，利用二代测序数据的UMI指导进行 ONT测序的数据拆分。

测试样本

某人类PBMC样本，采用最新GPU进行Super高精准度Basecalling。尽管大大提高了计算消耗，但预期可以得到最佳的单碱基质量。

测试结果

一、下机数据统计

下机数据质控统计表

Reads长度分布图

单张测序芯片的产量为36.7Gb，pass产量为29Gb。尽管产量仍有提升空间，但通过芯片及算法的升级，basecalling的准确度有了大幅度的提升，reads平均分可达到15.98，最终获得了20 Mb的reads进行下游分析，和其他长读长平台所产生的reads数相比，有着明显的产量优势。该芯片样本为单链测序样本，相信在”Duplex”的模式下，样本的测序准确度会有更进一步的提升。

2. 与参考基因组比对identity

左图Q20+R10.4的比对identity分布图，右图为LSK110 R9芯片的比对identity分布图

从图中可以发现，同个样本不同的测序试剂和芯片，对于最终比对identity的准确性有着显著的差异。LSK110 R9 base-calling fast模式的比对identity中位值在87.1%，Q20+R10.4的比对identity中位值达到了97.9%。整体数据的准确度有了明显的提升。

3.数据分解率

随着数据准确性的不断提高，利用二代UMI数据指导拆分三代全长转录组数据的比例也会有相应的提升空间，内部数据表明二代UMI数据指导拆分三代全长转录组数据的拆分率可达70%，远远高于Nature Communication文章里50%的拆分率。相信在“Duplex”模式下的数据表现会有更加亮眼。敬请关注希望组后续的相关报道！

当10x单细胞样本遇上Oxford Nanopore Q20试剂及R10.4芯片，有效提升UMI的数据拆分率，拥有更多有效数据进行下游分析。尽管“Q20+”目前处于试测阶段，但相信未来在基因组、转录组上的应用场景会不断增加。希望组早在2020年年底已经推出了利用纳米孔平台进行单细胞全长转录组的产品SCAN-seq。现在有了Q20试剂的加持，拓宽了单细胞全长转录组的应用场景和需求，可以为广大科研工作者提供更好、更优质、更前沿的技术！

背景资料

百岁兰(Welwitschia mirabilis)又名千岁兰，是买麻藤类单种科百岁兰科孑遗植物，系裸子植物中唯一的草状木本，是一种十分罕见的植物。化石记录百岁兰曾经广泛分布于巴西、葡萄牙等地。随着大陆板块分裂，气候骤变，自然居群幸存于如今的安哥拉与纳米比亚沙漠(纳米比亚国花)。是《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ保护植物，被国际植物学会列为世界八大珍稀植物之一。百岁兰一生只有两片叶子，持续生长不脱落，叶子寿命为植物界最长，其个体在原产地可存活达3000年之久，故此得名。

图1，百岁兰形态、生境及其分布

图2. 百岁兰基因组演化动态和历史

图3\4. 百岁兰甲基化图谱，重度甲基化百岁兰基因组脱氨基导致的低GC

图5/6/7. 百岁兰特性扩张基因家族及新老叶段基因家族的差异表达