2021.03.01,Nature Communications杂志在线发表题为“Single-molecule long-read sequencing reveals a conserved intact long RNA profile in sperm”的研究论文，由美国罗切斯特大学李鑫团队与爱荷华大学（现俄亥俄州立大学）区健辉团队合作发表。该研究利用三代测序技术检测了精子细胞中完整的 long RNAs（spiRNAs），在小鼠和人类精子中分别检测到了3440和4100种 spiRNAs。结果显示，这些spiRNAs种类上包含mRNA和long non-coding RNAs，进化上spiRNA在小鼠和人类之间是相对保守的，并且在编码核糖体的mRNAs中显示富集。该研究描述的完整long RNAs图谱为进一步研究其生物成因和功能提供了基础，同时本研究中的策略和自主开发的生物信息分析流程为其它类型样本完整longRNAs鉴定提供了参考。希望组提供了本次研究的部分三代测序服务。

文章题目：Single-molecule long-read sequencing reveals a conserved intact long RNA profile in sperm
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2021.03.01
影响因子：12.121
测序技术：Pacbio Iso-Seq、Illumina、Nanopore cDNA全长转录组

主要研究结果

1.小鼠精子中存在完整的long RNAs且与精巢中的有明显不同

 

本研究证实了小鼠精子存在完整的 long RNA，共检测到了来自1,624个基因位点的3,440 种spiRNA ，其中有755种spiRNA和参考序列中已报道过的完全相同，198种spiRNA的基因位点是全新的，7种spiRNA是已知基因位点的反义链(图2a)，2479种为已注释位点的新转录本(图2b），研究发现这些新转录本大多由APAs作用产生而来，只有少部分是由可变剪切和选择性转录起始产生（图2c)。此外检测到了1个跨越两个邻近基因的spiRNA（图2d)。与精巢中的完整转录本不同，spiRNA 长度更短（963nt)且有特异性功能富集，基于GO富集分析，spiRNA最显著富集之一的是编码80S核糖体的mRNAs（图4a），而这在精子成熟过程中是不需要的，说明spiRNAs具有组织特异性。

图2：精子中存在完整的long RNA转录本.

2. spiRNAs包含mRNAs和lncRNAs

为了验证spiRNAs在精子发生发生过程中的编码潜力，研究者们结合已有的Ribo-Seq数据库分析后，将小鼠的spiRNAs分成了2343个mRNAs和1097个lncRNAs，RPFs（ribosome protected fragments）在spi-mRNAs的编码区富集（图3a），并且发现在spi-mRNAs上富集的RPFs呈现出了三核苷酸的周期性 （three-nucleotide periodicity）（图3b）。此外该研究还验证了新转录本的潜在编码功能，来自已知位点的共2479个新isoforms中有1538个被注释为mRNAs， RPFs也分布在新的外显子序列中（图3c），这说明spi-mRNAs中的RPFs是可以进行翻译的。而对于来自新位点的198个新转录本，研究者们观察到78个已经注释的mRNAs和120个lncRNAs（图3d,e）之间存在明显差异，这种现象和全转录本中相似（图3a,b）。

图3 spiRNAs include both mRNAs and lncRNAs

3.小鼠与人类之间的spiRNA profile在进化上是保守的

为了检测spiRNA在进化上的保守性，研究者们同时还对人类精子RNA进行了测序 （图5），分析后共检测到2205个基因位点中的4,100 spiRNAs ，包括3517个mRNAs和583个lncRNAs。对比发现小鼠和人类共有562个spiRNAs相同（图4c)。以所有人类spiRNA genes 作为背景进行GO富集分析，结果显示编码蛋白质合成的mRNAs得到了富集（图4d)，与在小鼠精子中的发现一致（图4a)。研究者们进一步分析了非核糖体mRNAs，发现小鼠和人类依然存在明显的重叠。说明可能存在一种保守机制决定spiRNAs序列库。

 

图4  The spiRNA profile is evolutionarily conserved

 

 图5 Diverse transcripts in human sperm

总结与讨论

这项研究证明了精子中存在完整的 long RNAs，并在编码核糖体蛋白功能中显示富集，其功能与精巢中的RNAs不同，说明其具有一定的组织特异性。而另外发现的spiRNA在小鼠和人类中具有保守性，说明可能存在一种潜在的保守机制决定着spiRNAs序列库。

总之，该研究结合自助开发的研究策略和生物信息分析流程，揭示精子细胞中的完整RNA图谱，推动了RNA介导的表观遗传学研究，并为该领域进一步的研究提供了宝贵资源。

2009年首个单细胞转录组测序技术问世，开启了单细胞组学时代（scRNA-seq）（Tang et al., 2009）。过去十余年间单细胞测序技术的不断发展极大地加速了生物医学领域的相关研究，帮助科研人员克服了稀有生物样本以及生物样本内生异质性等重大挑战，一系列模式生物及人类自身的单细胞转录组图谱也由此诞生。然而目前的单细胞测序技术几乎全都是基于二代测序平台，测序读长短，一般在150bp左右，即使采用双端测序技术，测得的有效读长也不超过500bp。而人类转录组中转录本的长度普遍在1000bp以上，有些转录本长度甚至超过100kb（Piovesan et al., 2016; Frankish et al., 2019），远远超过二代测序方法所能检测的最大读长。

为了解决基于二代测序平台的单细胞转录组测序技术难以获得单个细胞中全长转录本的准确信息这一核心困难， 2020年12月30日，北京大学未来基因诊断高精尖创新中心、生物医学前沿创新中心汤富酬课题组与北京希望组生物科技有限公司合作在Plos Biology上在线发表了题为“Single-cell RNA-seq analysis of mouse preimplantation embryos by third-generation sequencing”的研究论文。该研究的主要突破有：

1）开发了一种基于三代单分子测序平台的高灵敏度单细胞转录组测序方法—SCAN-seq （Single cell amplification and sequencing of full-length RNAs by Nanopore platform），能够在单细胞分辨率直接获取全长转录本序列信息，表现出高灵敏度和高稳健性，在小鼠胚胎干细胞每个单细胞中可以检测到8000多个基因的表达，与之前基于二代测序平台最灵敏的单细胞转录组测序方法不相上下（如图1所示）。

图1 SCAN-seq的流程和评估

2）鉴定出了30000多种全新的转录本。总共只测序了200多个单细胞就在小鼠胚胎干细胞（mESCs）和小鼠植入前胚胎中分别鉴定出6487条和27250种新转录本。相比基于二代测序平台的所有单细胞转录组测序方法，SCAN-seq能够区分新找到的转录本是来自同一已知转录本的新转录本，还是来自不同已知转录本已注释剪接点的重新组合的新转录本（如图2所示）。

图2 未注释转录本的鉴定

3）首次提出单细胞转录组三代测序数据可以将一个单细胞中的父母源转录本准确区分开、分别进行精准定量分析。SCAN-seq显示出在同一个单细胞中精准识别小鼠品系特异性单核苷酸多态性（SNPs）的能力，平均误差率只有1.8%。利用这一方法，在单细胞分辨率确认了小鼠2-细胞期后的胚胎细胞中父源等位基因的mRNA比例逐渐增加，到囊胚期时每个胚胎细胞中来自母源和父源等位基因的mRNA拷贝数变得相当（如图3所示）。

图3 等位基因特异性转录本的分析

该研究开发出的SCAN-seq新方法具有广阔的应用前景，能够克服单细胞转录组二代测序方法的各种局限性，将单细胞组学测序从“二”时代推进到“三”时代：（1）从一般只能测序单细胞中cDNA一端的有限信息，提升到能够测序单细胞中cDNA的全长信息；（2）从单细胞中一个基因的所有不同可变剪接产物（转录本）混合测量无法区分，提升到把单细胞中每个基因的所有不同可变剪接产物（转录本）精准分开；（3）从单细胞中一个基因的父母源表达信息混合在一起无法区分，提升到把单细胞中每个基因的父母源转录本精准分开；（4）从只能在单细胞中检测独特序列基因的转录本信息，提升到同时也能精准检测单细胞中高度重复序列的转录本信息；（5）从“一个基因，一个表型”的精度（one gene, one phenotype；人类基因组中有大约3万个基因），提升到“一种基因可变剪接转录本，一个表型”的精度（one RNA isoform, one phenotype；人类基因组中有大约30万种不同的可变剪接转录本）。总之，单细胞转录组三代单分子测序技术将揭开更多的转录组中“暗物质”的奥秘，给人类生物医学研究带来全新的发展机遇。

生物岛实验室研究员范小英、北京大学生命科学学院博士生廖雨涵和北京希望组生物科技有限公司汤冬硕士、李丕栋硕士为该论文的并列第一作者。北京大学未来基因诊断高精尖创新中心、生物医学前沿创新中心汤富酬教授与北京希望组王洋博士为该论文的共同通讯作者。该研究项目得到了国家自然科学基金委、北京市科技委和北京大学未来基因诊断高精尖创新中心的支持。

希望组作为三代测序的引领者，一直深耕三代测序领域，引进国际先进的PacBio Sequel II、ONT PromethION 48、MGISEQ2000、Bionano Saphyr光学图谱等技术平台，为科学研究和临床检测等提供多平台多水平的测序分析服务。利用单细胞结合三代测序平台，获取全长转录组信息，可为研究“一种基因可变剪接转录本，一个表型”打下夯实的基础。欲详细了解单细胞转录组三代测序服务及更多应用场景，可邮件联系sales-support@grandomics.com或联系希望组当地销售顾问。

参考文献：

382. Tang, C. Barbacioru, Y. Wang, E. Nordman, C. Lee, N. Xu, X. Wang, J. Bodeau, B.B. Tuch, A. Siddiqui, et al. (2009). mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods, 6, 377-382.

Piovesan, A., Caracausi, M., Antonaros, F., Pelleri, M. C., & Vitale, L. (2016). GeneBase 1.1: A tool to summarise data from NCBI Gene datasets and its application to an update of human gene statistics. Database (Oxford), 2016, baw153.

Frankish, A., Diekhans, M., Ferreira, A. M., Johnson, R., Jungreis, I., Loveland, J., et al. (2019). GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766–D773.

近日，农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室刘胜毅课题组联合湖北大学，在the Plant Journal杂志在线发表题为“A global survey of the transcriptome of the allopolyploid Brassica napus based on single molecule long-read isoform sequencing and Illumina-based RNA-seq data”的研究文章。本文结合了三代测序技术(Pacbio)和二代测序(Illumina)，在转录本水平上探索甘蓝型油菜Brassica napus转录组的复杂性。这些数据提供了丰富的转录组资源，这将有利于基因组的重新注释，加强我们对B. napus转录本的了解，并应用于功能基因组的进一步研究。童超波研究员为通讯作者，姚胜黎为第一作者，希望组梁帆为共同作者。希望组参与了本文中的PacBio测序和分析工作。

研究思路

选择甘蓝型油菜栽培种“ZS11”，取不同发育时期的叶片、根、花芽、角果、愈伤组织等，提取总RNA后等量混合进行三代测序（Iso-Seq），各样本分别进行二代转录组测序。三代测序选用PacBio RS II平台，构建4个文库，共测31个cell：0-1 kb 5个cell；1–2 kb 10个cell；2–3 kb 10个cell；>3 kb 6个cell。二代测序选用HiSeq 4000 平台，每个组织部位2-3个重复，共测123M reads。

主要结果

1    特征数据统计

三代数据共得到1161468个ROI，其中72.2%是全长非嵌合序列。47%的全长序列唯一比对到基因组，三代测到的转录本平均长度为2487 bp，明显长于基因组上已有注释的转录本平均长度。矫正后，单碱基错误率降至 1.50%( 0.26% insertions, 0.27% deletions and 0.97% mismatches)，校正后，BUSCO比对的完整性提升到83%。

图1  转录本平均长度

2    已有数据横向比较

将Ensembl Plants Database中已有的cDNA序列与本次测得序列比较，数据库中的26346个序列与PacBio测得的63714个序列匹配上，且PacBio测到的全长cDNA更长。将非冗余的147698个转录本和之前已经测序的Darmor-bzh进行比较，发现有142476个转录本能够覆盖到37403个基因位点，其中31392个基因位点是多外显子基因。未比对上这个基因组的5222个转录本中，有4947个转录本可以比对到近源物种（拟南芥，白菜，甘蓝），这表明有些转录本可能是栽培种ZS11特有的。

 

3    可变剪接

共检测到222061个可变剪接事件，来自15068个基因位点，主要是内含子保留（IR)，其中128967个转录本是现有基因组上未注释到的。统计显示，20230个多外显子基因有用多个剪接异构体，其中5761个基因能够产生5种以上异构体。比如，BnaC01g03120D在基因组注释上仅有1个转录本，但是PacBio测到了14个不同的剪接异构体。另外发现，可变剪接在An亚基因组中更为普遍。

图2  BnaC01g03120D转录本可视化

4   LncRNA鉴定及验证

鉴定到20个已知lncRNA，529个新lncRNA，平均长度1.7 kb，lncRNA具有明显组织特异性。两个亚基因组中的同源基因分别产生了54和53个lncRNA，结果表明两个亚基因组的贡献是相等的。

图3  各样品中lncRNA的表达量

5    APA分析

分析poly(A)位点的侧翼序列，发现上游富集尿嘧啶(U)和下游富集腺嘌呤(a)的核苷酸偏好明显。在polyA的上游，我们鉴定到了两个保守的加A信号，AAUAAA和UGUA。从两个亚基因组得同源基因对中分别鉴定到13812和14184个poly(A)位点，3299和3522个APA基因。An亚基因组的同源基因对polyA位点产生的贡献小于Cn亚基因组的同源基因。

图4  MEME分析转录本中的poly(A)信号

图5  各组间差异AS事件统计

• Ø  将测序数据分别与现有数据库、近源物种比较，锁定品系特有基因集，为品种优势研究奠定基础；
• Ø  将ROI比对到不同的亚基因组上，区分不同亚基因组对AS、APA和lncRNA的贡献度；
• Ø  针对AS、APA和lncRNA进行大量的RT-PCR验证；
• Ø  二代定量和三代定性相结合，引入科学问题“温度、组织对AS的影响程度”，通过组间比较找到关键影响因素和相关基因。