2019年转眼间已经过半，未来组三代测序项目成果也接连不断，今天组学君就给大家带来2019上半年未来组三代测序项目的8篇高分文章，累积IF达101.775涵盖动植物基因组、转录组、微生物基因组、表观遗传研究等各个领域，为您提供三代测序应用的高分文章思路。

01

栽培种花生（Arachis hypogaea L.）为异源四倍体（AABB，2n= 4x = 40），亚基因组之间的密切关系和高比例的重复序列增加了栽培花生基因组的组装难度。

本研究以狮头企花生为材料，采用三代测序技术，结合Hi-C技术和高密度遗传图谱等完成了异源四倍体花生栽培种A、B亚基因组共20条染色体的精确组装，获得高质量的参考基因组。

比较基因组分析表明花生B亚基因组具有更多的基因和普遍的表达优势，52份种质材料的重测序分析表明花生可能起源于不同的subsp. hypogaea并且在不同地点独立驯化，同时，作者也对A亚基因组的真正起源提出了疑问。

02

苹果基因组是苹果遗传研究和分子育种的基础，可推动苹果的可持续生产。尽管早前发布的高质量金冠（Golden Delicious）基因组使苹果育种研究取得了一些进展，但仅仅利用这些数据在发现新基因和描述基因组结构变异方面仍存在一些局限性。

本研究以来源于花药的苹果纯合系HFTH1为材料，采用三代PacBio测序技术，结合光学图谱Bionano和Hi-C技术辅助组装，获得高质量苹果基因组图谱(contigN50为6.99Mb，GDDH13基因组contigN50为620kb)。

比较基因组结果表明，TEs的动态变化可导致产生大量的SVs，这可能会对基因型产生影响。进一步研究证实了上述推测，研究者发现花青素生物合成的核心转录激活因子MdMYB1上游UTR区域的一个LTR反转录转座子的插入与果实红色相关联。

本研究的高质量参考基因组对GDDH13基因组进行了补充，可精确识别大的和复杂的SVs，同时，为苹果独特的生物学特征的比较基因组研究和种类基因组多样性研究奠定基础。

03

细菌耐药性一直是微生物研究的重点领域，随着碳青霉烯类药物和黏菌素耐药性的爆发，替加环素成为治疗多重耐药细菌感染的最后一道防线。

本研究发现了一个质粒介导的可移动的替加环素耐药基因tet(X4)，将该基因转入到大肠杆菌能显著增强其对所有四环素类抗生素的耐药性。而且，包含tet(X4)基因的IncQ1质粒具有高效转移能力，这极大地增加了该耐药基因的传播风险。

研究者进一步探讨了tet(X4)阳性大肠杆菌在中国人群、家禽家畜及其周边环境中的流行情况，提出“one-health”策略，即通过对人类、动物及其生活环境进行跨部门监测和控制来应对抗生素耐药性，同时呼吁人们在动物和环境中合理使用四环素。

04

深度循环神经网络广泛应用于人工智能领域，如手写识别、语音识别等序列特征建模。

研究者采用LSTM-RNN深度循环神经网络作为深度学习框架，采取两种独立的策略利用多个Nanopore测序数据集进行训练和校正，完成了5mC和6mA检测模型的建立。

该研究为Nanopore应用于表观修饰领域提供了重要的软件工具—DeepMod。首次将5mC的准确率提高到99%，实现了5mC的精准检测；首次建立了原核和真核通用6mA和5mC检测方法；并建立了首个Nanopore真核生物6mA修饰标准集。

05

糜子(Panicum miliaceum L.)作为一种古老的作物，具有生长周期短（~60–90d），耐盐碱的特性，尤其是极端抗旱，其耐旱能力甚至比蒸腾系数低于高粱、玉米、小麦的谷子还要强。

本研究结合了三代长读长测序技术、二代短读长测序技术、Bionano光学图谱、Hi-C染色体构象捕获等技术优势，获得了高质量的糜子基因组，通过对糜子基因组的深度挖掘，研究者揭示了糜子基因组中与抗生物胁迫和非生物胁迫的可能相关基因。系统发育分析揭示了糜子的异源四倍体化发生在591万年之内，而糜子和谷子的分化大约发生在1310万年前。

高质量糜子基因组序列不仅对理解糜子基因组四倍体化后的动态进化具有重要意义，而且对今后的糜子分子育种也有一定的参考价值，并将促进黍属植物与其他作物的比较基因组研究。

06

本研究以生活在马里亚纳海沟6，000m深处以下的狮子鱼Pseudoliparis swirei为研究对象，通过形态学、基因组和转录组等多种分析手段揭示了马里亚纳海沟狮子鱼深海适应性的形态、生理变化及分子机制。

形态学观察发现，P. swirei具有一系列适应深海生活的形态特征，如透明的皮肤，膨大的胃部，不完全骨化的骨骼以及非闭合性颅骨。基因组分析显示P. swirei在骨骼发育、细胞膜流动性、蛋白质稳定性存在深海适应性基因突变。

本研究中发现的众多遗传变化揭示了脊椎动物物种如何在深海中生存和繁衍，提供了对脊椎动物的形态，生理和分子进化新的见解。

07

核小体的动态占据导致两种不同的染色质状态：“开放”（具有稀疏核小体的活跃基因组区域）和“闭合”（具有致密核小体的不活跃基因组区域）。核小体的占据和染色质开放状态的动态变化在转录、DNA复制和修复中起重要的调节作用。

本研究提出的一种新的实验方法MeSMLR-seq，实现了在长距离-单个核苷酸分子水平进行核小体和染色质状态测定，为基因表达的染色质调控研究提供了一个有力工具。

研究者利用MeSMLR-seq的独特序列，揭示了转录起始位点周围沉默基因和活跃基因具有差异的核小体组织原则。利用多个基因组区域的染色质状态与单细胞RNA-seq数据一起，揭示了转录重编程过程中相邻基因的染色质偶联变化。

08

Nanopore 长读长Direct RNA测序不需要经过反转录可获得完整的RNA转录本。

本研究通过 5’-Cap捕获的方法富集全长RNA转录本，利用Nanopore对RNA直接进行测序，以天然RNA形式描述飞蝗全长转录本特征。研究者分析了蝗虫转录中TE外显子化模式，揭示了TE外显子化的广泛建立以及蝗虫转录组中TEs对RNA剪接的重要作用。

该研究结果证明了5’-Cap捕获法的Direct RNA测序在描述包含重复序列的全长RNA转录本中具有重要作用。这是国内Direct RNA测序相关研究成果的首次亮相，武汉未来组承担了Direct RNA的建库测序工作。

2019年6月14日，美国俄亥俄州立大学的区健辉（Kin Fai Au）博士团队在Genome Research（IF=9.944）杂志在线发表题为“Single-molecule long-read sequencing reveals the chromatin basis of gene expression”的研究论文，该研究提出一种新的实验方法MeSMLR-seq（methyltransferase treatment followed by single-molecule long-read sequencing）外源甲基转移酶处理后进行纳米孔测序，从而实现在单个核苷酸分子水平进行核小体和染色质状态的长距离测定。区健辉课题组的王运浩博士和王安琪博士为共同第一作者，武汉未来组承担了其中的ONT建库、测序工作。

在真核生物中，细胞面临遗传信息存储和包装问题。DNA作为遗传信息的载体，通过缠绕组蛋白八聚体（H2A, H2B, H3和H4）形成染色质的基本单元——核小体。核小体由”linker DNA”连接伸长，核小体的动态包装导致两种不同的染色质状态：“开放”（具有稀疏核小体的可访问和活跃基因组区域）和“闭合”（具有致密核小体的不可访问和不活跃基因组区域）。核小体的配置和染色质开放状态的动态变化在转录、DNA复制和修复中起重要的调节作用。

基于第二代“短读长”测序技术或单细胞测序技术的方法可以在群体或单细胞水平检测核小体配置和染色质开放状态，但是无法提供复杂的长距离核小体配置和染色质开放状态的异质性信息。牛津纳米孔测序技术（Oxford Nanopore Technologies，ONT），利用碱基穿越纳米孔时产生的原始电信号信息在单分子水平检测DNA修饰，无需PCR扩增和亚硫酸氢盐转化，并且极大地增加了测序的长度。因此，ONT测序read可以覆盖多个核小体的组合和跨越多个基因组元素的不同染色质状态。

本研究利用ONT测序的长read序列和丰富的单碱基原始信息，开发了MeSMLR-seq方法（图2）和相应的生物信息学工具NP-SMLR，来研究长距离核小体配置和染色质开放状态的异质性及动态变化。

图2 MeSMLR-seq 流程

研究者首先对酵母基因组中的核小体配置进行单个DNA分子水平的检测和定相，在不同核小体覆盖度下的检测均能达到80%准确度，表明了MeSMLR-seq对核小体单分子远程比对的准确性和稳健性（图3）。在单细胞水平检测发现，单个MeSMLR-seq读数跨越长距离范围，可以测定多个核小体（中位数为37），因此，MeSMLR-seq可捕获DNA分子中核小体占有率的动态性和异质性。

图3 利用MeSMLR-seq数据进行5mC检测和核小体占有率检测

转录起始位点在转录调控中有重要作用，MeSMLR-seq揭示了其周围沉默基因和活跃基因的差异核小体组织原则。对于转录沉默的基因，在一个细胞群体中核小体配置具有更大的异质性；而对于转录激活的基因，核小体的间距分布具有更高的一致性（图4）。

进一步研究表明基因表达与染色质开放状态之间呈正相关关系，随后进行了单分子染色质开放状态长距离比对性能的评价，结果表明MeSMLR-seq能够分析相邻基因的偶联染色质状态，检测细胞群中染色质状态的异质性。最后，对两个相邻的葡萄糖转运蛋白基因的染色质偶联状态变化研究表明，Open-HXT3与Closed-HXT6耦合模式的细胞亚群比例随葡萄糖浓度降低而降低，而Closed-HXT3 and Open-HXT6耦合模式的则相反（图5）。

图5 HXT6和HXT3基因的染色质开放状态与共表达之间的“偶联”关系

综上所述，本研究提出的一种新的实验方法MeSMLR-seq，实现了在长距离-单个核苷酸分子水平进行核小体和染色质状态测定，为基因表达的染色质调控研究提供了一个有力工具。本研究利用MeSMLR-seq的独特输出，对转录起始位点周围核小体的组织规则以及组合的异质性进行了研究。最后利用多个基因组区域的染色质状态与单细胞RNA-seq数据一起，定量研究了染色质开放状态与基因转录之间的关系，揭示了转录重编程过程中相邻基因的染色质偶联变化。