2019年4月16日，中科院深海科学与工程研究所，水生生物研究所以及西北工业大学生态与环境保护研究中心等多家单位，在Nature ecology & evolution上发表题为“Morphology and genome of a snailfish from the Mariana Trench provide insights into deep-sea adaptation”的研究成果。中科院深海所和水生所何舜平研究员以及西北工业大学王文教授、邱强教授为本文共同通讯作者。西北工业大学王堃助理教授、兰州大学杨勇志研究员、水生所沈彦君博士及甘小妮副研究员为本文并列第一作者。本研究以生活在马里亚纳海沟6，000m深处以下的狮子鱼Pseudoliparis swirei为研究对象，通过形态学、基因组和转录组等多种分析手段揭示了马里亚纳海沟狮子鱼深海适应性的形态、生理变化及分子机制。武汉未来组有幸完成了该项目的三代测序工作。马里亚纳海沟（Mariana Trench）是世界上已知的最深的海洋地带，低温、黑暗、缺氧、有限的食物资源以及极高的静水压力（约1,000标准大气压）使其成为地球上最恶劣生存环境之一。狮子鱼（Liparid snail-fishes）是最常见的超深渊脊椎动物，也是超深渊环境中的顶级捕食者。马里亚纳深渊狮子鱼(Mariana hadal snailfish,MHS)的形态特征
研究者在马里亚纳海沟多个位置捕获到MHS，体型形状与生活在浅海区域的Tanaka狮子鱼相似，但是MHS表皮透明可以清晰的看到腹腔内的肌肉和内脏（图1a,b）。此外MHS还表现出其他适应深海环境的形态特征，比如扩大胃，肝脏和卵子，更薄的肌肉和不完全骨化的骨骼。
图1. MHS与Tanaka’s snailfish形态对比
利用PacBio第三代单分子实时测序技术以及二代Illumina对MHS进行测序，最终获得了684Mb的高质量MHS基因组，scaffold N50为418Kb。BUSCO数据库评估表明基因组的完整性为91.7％，与其他硬骨鱼类的完整性相当。研究者还对15个组织的28个样本进行了转录组测序，超过89%的转录本序列能够比对到基因组上，进一步验证了组装基因组的完整性。同时，研究者还对浅海狮子鱼Tanaka进行测序组装，结果发现MHS比Tanaka的基因组大了150 Mb（约21.9%），这可能主要是由于MHS基因组中重复序列的扩展造成的，而MHS基因组的其他特性，包括其GC含量，密码子，基因长度和外显子数与Tanaka中的相似，暗示它们可能不是导致MHS能够适应深海环境的因素。
研究者利用9种硬骨鱼类的蛋白质序列（MHS，Tanaka，棘鱼，河豚，阔尾鱼，鳕鱼和斑马鱼，比目鱼和太平洋蓝鳍金枪鱼）构建系统发育树（图2a），发现MHS和Tanaka在大约2,022万年前发生了分化，这比马里亚纳海沟的形成时间早了1,000万年。对两个物种的动态有效种群大小（Ne）的估计表明，MHS的种群数量大于Tanaka种群，并且在大约5万年前经历了显著的种群扩张。MHS种群相当大，具有丰富的遗传多样性。
在这9个物种中，MHS具有最低的突变率（图2c），全基因组水平MHS的突变率也低于Tanaka和棘鱼（图2d）。研究表明突变率对多种因素特别是世代时间敏感，同时观察到雌性MHS产生的卵子数量少于其他种类狮子鱼的雌性，因此，MHS较长的世代时间可能与其低突变率相关。
图2. MHS的进化历史
生活在地球表面的脊椎动物已经闭合了由硬骨包围的颅骨空间，以保护大脑并维持适当的颅内压。然而，封闭的头骨在非常高的环境压力下不能保持其结构完整性，大多数深渊动物都是无骨生物。MHS却是个例外，使用计算机断层扫描发现MHS的颅骨未完全闭合（图3a,b）这使得其可以平衡内外部压力，更重要的是MHS的大部分骨骼是软骨。研究发现MHS的骨钙素基因bglap，发生了移码突变（图3c）,作者利用斑马鱼（Danio rerio）为实验材料，通过抑制bglap基因的表达结合钙黄绿素染色（图3d-g），证明了bglap提前终止可能与MHS不寻常的颅骨结构和骨骼硬度降低有关。
接着对MHS的晶体蛋白和视蛋白基因的变化进行了比较基因组分析，发现它已经失去了几个重要的光感受器基因，并且色素沉着基因mclr在该物种中完全丢失。这些结果与MHS对深海探测器的灯光没有反应，失去了皮肤色素沉着，变得透明等表型特征相适应。
图3. MHS不完整的颅骨与骨钙素(bglap)基因的过早终止表达有关
众所周知，细胞膜是含有磷脂双分子层和蛋白质的可流动结构。而深海极高的静水压降低了脂双层的流动性和相变可逆性，最终导致膜相关蛋白的变性和功能失调。对9个硬骨鱼基因家族分析发现，MHS中与脂肪酸代谢相关的基因家族显著扩增。深海适应生物比浅海生物的膜含有更高含量的不饱和脂肪酸，其中二十二碳六烯酸（DHA）可以显著改变膜的芳基链顺序和流动性，渗透性和高压下的蛋白质活性。Acaal基因编码的蛋白质是DHA合成过程的限速酶，研究者发现MHS基因组有15个acaal基因拷贝，而所有其他完全测序的硬骨鱼类只有5个拷贝，同时参与DHA生物合成的另一个基因fasn也在MHS基因组中表现出拷贝数增加。这些变化可能会增加生物膜液体脂质的丰度，使其适应深海的高静水压环境。
其他显著扩展的类别包括具有离子和溶质运输功能相关的基因家族，这提供了揭示MHS适应极端静水压力的线索。GO分类表明相比Tanaka，MHS中“离子转运”，“跨膜转运”和“钙离子转运”蛋白进化速率显著增加，这些基因谱系的特异适应性进化可能与膜转运系统活性有关，帮助鱼在高压下茁壮成长。
图4. MHS基因组的基因家族扩展与适应性进化
静水压通过影响蛋白质折叠和酶活性抑制其功能。生活在很深处的物种必须保持细胞内环境，抵抗高压，维持蛋白质结构特性。目前有两种机制解释深海生物蛋白质活性维持，分别是生理适应和结构适应。
Trimethylamine N-oxid（TMAO）是一种生理上重要的蛋白质稳定剂，可以将变性蛋白质恢复到其天然结构。大多数硬骨鱼类基因组含有5个拷贝的TMAO合成酶——黄素单加氧酶3（fmo3），其中4个是串联重复序列（图5a），而第一个拷贝fmo3a基因在MHS的肝脏中强烈表达，并且fmo3a在MHS中被正向选择。作者预测MHS中该基因上游有5个拷贝启动子比浅海狮子鱼（1个拷贝）或棘鱼（2个拷贝）更多。这些发生在基因编码及调控序列的变化可能有助于MHS增加细胞内TMAO水平以增强蛋白质稳定性。
蛋白质对深海条件的结构适应包括氨基酸取代模式和蛋白质结构的改变，MHS与其他物种的氨基酸组成和所有编码基因的替换相互比较，所有蛋白质中不存在全局性的组成和替代变化。进一步对各基因家族聚合氨基酸取代进行分析，仅有hsp90基因表现出高可信度的聚合氨基酸变化——在MHS的hsp90蛋白5个拷贝中，有4个独立地发生了同样的丙氨酸-丝氨酸取代，这一位点在人类、小鼠、鸡、变色龙和酵母的相应蛋白质中是高度保守的位点（图5b）。Hsp90是一种进化上保守且高度丰富的分子伴侣，可促进200多种蛋白质的正确折叠和活化。四个MHS hsp90亚型同源性建模发现在相对保守的基序FYSSX中具有丙氨酸-丝氨酸突变，并且所有突变的丝氨酸都位于ATP结合袋附近，并可能对影响hsp90活性的局部结构相互作用有重要影响（图5c）。
图5. 在MHS中增加蛋白质对静水压力的稳定性
总 结
研究者利用深海探测器在马里亚纳海沟首次发现狮子鱼Pseudoliparis swirei，也是目前我国在深海获取样本的最大深度（7，415m），该研究解析了脊椎动物适应深海海沟极端环境的遗传基础：
1. 形态学分析发现，与浅海区域的Tanaka狮子鱼不同，P. swirei具有一系列适应深海生活的特征如透明的皮肤，膨大的胃部，不完全骨化的骨骼以及非闭合性颅骨。
2. 系统发育分析表明，大约2000万年前，P. swirei与居住在海面附近的近亲分开，具有丰富的遗传多样性。
3. 基因组分析显示：
a) 骨钙素基因（bglap）具有移码突变，可能导致软骨钙化的早期终止;
b) P. swirei的细胞膜流动性和转运蛋白活性可能因蛋白质序列和基因改变而增强;
c) 三甲胺N-氧化物（TMAO）合成酶和hsp90伴侣蛋白中的关键突变可能增加了其蛋白质的稳定性。
本研究中发现的众多遗传变化揭示了脊椎动物物种如何在深海中生存和繁衍，提供了对脊椎动物的形态，生理和分子进化新的见解。
DNA测序技术及生物信息技术的发展为物种的起源和进化研究提供了有力的科学依据。武汉未来组拥有PacBio Sequel、Oxford Nanopore、Bionano Saphyr光学图谱及Hi-C染色体构象捕获等技术和平台，助您打造高质量参考基因组，为后续进一步认识物种的遗传多样性以及适应进化等分子机制的研究提供保障。参考文献
Wang K, et al., Morphology and genome of a snailfish from the Mariana Trench provide insights into deep-sea adaptation. 2019. Nature Ecology & Evolution, https://doi.org/10.1038/s41559-019-0864-8.
汪总介绍到，早在2011年，我们的团队便开始致力于推动三代测序技术的应用，先后成立了武汉未来组（NextOmics）和北京希望组（GrandOmics），分别提供动植物基因组领域和医学领域的三代测序服务。目前，我们已经建立了处于国际领先水平的三代测序基因组中心，配备了Bionano Saphyr、Oxford Nanopore、PacBio等不同类型的长读长测序平台，与此同时还搭建了适用于第三代测序技术的大容量、高性能计算平台，可为全球客户提供优质的三代测序服务。汪总还分享了希望组近年来基于Oxford Nanopore测序平台获得的一些研究成果与经验，包括在动植物基因组组装、结构变异检测、表观遗传学研究、Direct RNA测序、算法开发等领域发表的文章，自主研发的针对Oxford Nanopore平台的生物信息分析软件Nextdenovo、组装算法和全新的利用深度学习的数据修饰检测软件， 以及实验流程的不断优化等。
