长江大学张文英教授课题组和澳大利亚技术科学与工程院院士、莫道克大学“西部作物遗传学联盟”主任李承道教授课题组合作，在植物科学国际权威杂志Plant Biotechnology Journal（影响因子13.263）在线发表题为“Genome architecture and diverged selection shaping pattern of genomic differentiation in wild barley”研究论文。研究者通过三代纳米孔测序，组装起源于以色列”进化峡谷”，峡谷南坡(干热的非洲坡)和北坡(冷湿的欧洲坡)的两个高质量野生大麦基因组。然后通过比较基因组学分析，群体遗传分析和转录组分析，研究了位于南坡和北坡两个野生大麦种群在非生物胁迫下的基因组分化和基因表达模式。

长江大学张文英教授，莫道克大学谈聪博士，莫道克大学胡海飞博士以及长江大学博士生潘锐为论文的共同第一作者，莫道克大学何田华博士，长江大学田小海教授和莫道克大学李承道教授为本文的共同通讯作者。本研究得到了中国国家自然科学基金，澳大利亚谷物研发公司（GRDC），主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心、长江大学科技创新团队基金等项目的资助，并得到Claire Mérot, Peter Civáň 和Rajeev Varshney教授对文章的宝贵修改意见。希望组提供长读长测序服务与部分生物信息分析工作。

以色列”进化峡谷”是模拟研究非洲和欧洲不同生境生物进化与多样性的天然实验室。尽管地理接近，与北坡(冷湿的欧洲坡)相比，峡谷南坡(干热的非洲坡)的太阳辐射更高（多 200-800%），使得南北坡呈现出显著的环境差异和生物群体（动物、真菌和植物的种群）分歧。适应不同的环境可能会通过不同的选择压力，来驱动基因组区域的变化。通过比较种群的基因组差异，包括大的结构变异（SV）和单核苷酸多态性（SNP），可以揭示具有局部分化序列的基因组区域，并进一步研究其对物种环境适应性的影响。

野生大麦（Hordeum spontaneum L.）是栽培大麦（Hordeum vulgare L.）的祖先，是栽培大麦改良重要的基因遗传资源。然而，我们对不同种群的野生大麦基因组分化和它们的基因组结构差异仍然知之甚少。在这里，研究者从头组装了分别位于以色列”进化峡谷”南坡和北坡（图1）的两个高质量野生大麦基因组 （图2）。位于南坡和北坡的两个野大麦种群具有共同的祖先，并且起源于地理上接近，但由于它们的不同的生长环境，导致经历了不同的选择压力。研究者进一步通过重测序和转录组手段研究两个种群在非生物胁迫下的基因组分化和基因表达模式。同时，发现了可能对分化表型产生重要影响的变异，例如影响两个野生大麦基因组之间的开花时间和干旱反应的变异。其中，一个29 bp 的启动子区域插入，在HvWRKY45基因中形成了顺式调控元件，这可能有助于增强南坡野生大麦对干旱的耐受性。启动子区域中的单个 SNP 突变可能会影响HvCO5表达并与其开花时间适应相关。研究者还揭示了两个群体之间的具有持续基因流动变，发现SNP 和小的 SV 通过局部适应与基因水平的遗传分化相关。相反，大的染色体倒位可能通过抑制染色体重组和基因流动形成染色体的基因组分化的异质模式（图3）。该研究为通过基因组研究环境适应性的遗传基础提供了新的见解，并为栽培大麦的遗传改良提供了宝贵的基因资源。

图1 以色列进化峡谷中的南坡和北坡的野生大麦种群，以及两个斜坡的气候差异

图2  野生大麦基因组组装与结构变异的新发现

图3 大染色体结构变异对异质模式的影响

2022年9月22日，中国农业科学院作物科学研究所联合多家合作单位，在《自然遗传学（Nature Genetics）》杂志上发表了题为“Improved pea reference genome and pan-genome highlight genomic features and evolutionary characteristics”的研究论文。论文进行了豌豆参考基因组的组装和注释，进一步确定了全基因组变异，并基于全基因组重测序数据展示了 118 个栽培和野生豌豆基因型的种群遗传结构。通过基因组选择和数量性状位点（QTL）分析，发现了一批与驯化和育种改良性状相关的候选基因，其中包括孟德尔基因的几个候选基因。高质量的参考基因组和泛基因组为豌豆基因组进化和驯化提供了洞察力，并为豌豆遗传学和育种研究提供了宝贵的基因组资源。

中国农业科学院作物科学研究所杨涛副研究员和刘荣助理研究员、中国科学院微生物研究所骆迎峰副研究员和胡松年研究员以及山东省农业科学院农作物种质资源研究所王栋助理研究员为论文的共同第一作者。中国农业科学院作物科学研究所宗绪晓研究员、中国科学院微生物所高胜寒特别研究助理、山东省农业科学院农作物种质资源研究所丁汉凤研究员、国际半干旱热带作物研究所和澳大利亚默多克大学Rajeev K Varshney教授为论文的共同通讯作者。希望组为本研究提供了部分Bionano光学图谱服务。

豌豆 (Pisum sativum L., 2n=2x=14) 是一年生豆科植物，基因组大小约为 4.45 Gb。豌豆的收获面积在豆类中排名第四，仅次于大豆、普通菜豆和鹰嘴豆（http://www.fao.org/faostat/）。作为蛋白质、淀粉、纤维和矿物质的来源，由于其生物固氮能力具有显著的生态可持续性优势，豌豆一直受到关注，特别是自从孟德尔通过豌豆遗传试验揭示了遗传规律之后。豌豆被认为是最早驯化的豆科作物之一，然而，尽管它在推进植物遗传学方面发挥了关键作用，但其驯化过程仍然是一个谜，豌豆中栽培和野生豌豆的遗传多样性尚未完全揭示。

研究思路

部分研究结果

1.豌豆基因组图谱构建

本研究结合使用 PacBio SMRT 测序、10x Genomics 、Bionano 光学作图、Hi-C 和 Illumina NGS 技术，对ZW6 的高质量、高连续性染色体参考基因组进行构建。最初基于 PacBio 读取的总大小为3,796.7Mb，contig N50 大小为 8.98Mb，最终组装被锚定到七个染色体水平的假分子中，具有两个细胞器基因组和 1,572 个未放置的重叠群（图 1 ）。锚定重叠群的总大小为 3,719.6Mb，占豌豆ZW6 的 97.96%，而锚定重叠群仅占之前基于 NGS组装的 82.51%。豌豆基因组图谱的获得，为豌豆巨大基因组背后遗传学的了解奠定了基础。

图1 豌豆基因组图谱

2.种群遗传结构

为了阐明豌豆中栽培和野生豌豆的系统发育关系和种群遗传结构，将 ADMIXTURE 应用于 SNP 和 SV 数据集，结果高度一致（图 2b、c ）。P. fulvum、P. sativum 和 P. abyssinicum 三种不同种的结构得到了一致支持。在 P. sativum 中鉴定了三个遗传组，其中 P. sativum IV （PSIV）代表早期分化组（图2b，c）。P. sativum II (PSII) 和P. sativum III (PSIII) 主要对应于代表不同地理区域（即亚洲和欧洲）栽培豌豆的两个遗传组，这可能与豌豆驯化后的传播途径有关（图2b，c）。用 SNP 和 SV 数据集构建的系统发育树（图 2a，d）显示出主要分支的相似系统发育关系，并且与 ADMIXTURE 结果的主要遗传组有良好的对应关系。此外，P. fulvum、P. abyssinicum和栽培的 P. sativum的 Pisum 形成了三个独立的单进化枝（图 2a，d），这也得到了 SNP 和 SV 数据集的主成分分析的支持（图 2e， f ）。

图2 基于SNP (a, b, e)和SV (c, d, f)的118份栽培和野生豌豆的群体遗传结构

DNA甲基化是控制基因表达和染色质组织的一个基本的表观遗传标记，从而为细胞身份和发育过程提供了一个窗口。目前的数据集通常只包括一小部分甲基化位点，并且这些数据来源基于细胞系或基于含有混合细胞的组织。

研究思路

研究结果

人类细胞类型甲基化图谱

所分析的细胞类型（图1）代表了大多数主要的人类细胞类型，允许对生理系统（例如胃肠道、造血细胞和胰腺）进行综合观察，并比较不同环境中的类似细胞类型。如图1所示，205个甲基体在复制之间表现出巨大的相似性，细胞类型之间以类似于块的方式发生了显著变化。作者试图识别特定细胞类型中差异甲基化的基因组区域，以阐明细胞类型特定的生物学过程，定义细胞身份，并促进甲基化生物标志物的开发，以识别循环cfDNA片段的细胞来源。

图1 成人人体甲基化图谱

甲基化记录发展历史

通过分析系统地将相同细胞类型的生物样本分组（图2），类似于纯化人血细胞的基于阵列的聚类。这支持了细胞分离的可重复性，并表明每种正常细胞类型的三到四次重复就足以推断其甲基化模式，用于生物标志物鉴定等实际应用。

图2 无监督凝聚聚类反映了健康细胞类型的人类发育谱系。单元格类型由边缘颜色表示

细胞类型特异性甲基化标记物

每种细胞类型的前25个差异非甲基化区域包括1246个人类细胞类型特异性甲基化图谱标记（图3）。片段水平分析进一步表明，与所有其他细胞类型中几乎没有的DNA片段相比，这些区域的绝大多数DNA片段在目标细胞类型中未甲基化。该图谱具有多种应用，包括循环无细胞DNA片段的分析。重要的是，只有约1%的细胞类型特异性标记物被亚硫酸氢盐减少表达测序（RRBS）覆盖，4-8%被甲基测序杂交捕获板覆盖，14-24%在单个CpG 450K/EPIC阵列中表达，强调了全基因组测序对生物标志物彻底鉴定的益处。

图3 39个细胞类型组205个样本的人类甲基化图谱

人类细胞类型特异性调控图

为了进一步评估细胞类型特异性非甲基化区域的生物学重要性，还研究了它们与转录因子（TF）的关系，转录因子可以影响DNA甲基化或以细胞类型特异的方式结合DNA，取决于甲基化和染色单体。对于大多数细胞类型，顶部图案包括主调节器和关键TF（图4b）。

图4 细胞类型特异性标记作为假定的增强子

细胞类型特异性高甲基化位点

对那些在一种细胞类型中甲基化但在人体其他地方未甲基化的基因组区域进行研究。这些蛋白富集于CpG岛（38%的甲基化区域，而1.7–2.7%的细胞类型特异性非甲基化区域），并且在其他细胞类型中由H3K27me3和Polycomb标记（图5a–c）。有趣的是，只有约3%的细胞类型特异性差异甲基化区域是高甲基化的。在汇集所有细胞类型特异性高甲基化区域后，发现了染色质调节因子CTCF的靶序列高度富集（图5d）。图5e显示了甲基化模式并在体内公布了CTCF在一个位点的占用情况，该位点在结肠和肠道中被特异性甲基化。与DNA甲基化阻止CTCF结合一致，ChIP数据显示结肠中该位点CTCF结合的选择性缺失。此外，在特定细胞类型中甲基化的位点富集了神经基因转录抑制因子RE1沉默TF/神经元限制性沉默因子（REST/NRSF）的靶点，这在胰岛细胞的甲基体中最明显（图5f）。

图5 细胞类型特异性的高甲基化区域富集CpG岛、Polycomb靶标和CTCF和REST/NSRF

片段级甲基化反褶积

如图6a所示，1246种标记允许以约0.1%的分辨率准确检测来自给定来源的DNA，与基于阵列的方法相比，提高了近一个数量级。然后，使用来自WGBS数据估计了白细胞和cfDNA的细胞组成；99.5%的白细胞衍生DNA来源于粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和NK、T和B 细胞，与典型的血液计数一致（图6b）。健康受试者的cfDNA主要来源于白细胞：粒细胞（29.7%）、单核细胞/巨噬细胞（20%）和淋巴细胞（3%）。有助于cfDNA的实体组织包括血管内皮细胞（6%）和肝细胞（3.1%）（图6c），与先前的结果一致。目前的图谱还显示巨核细胞（31%）和红细胞祖细胞（5%）对cfDNA的显著贡献，这在以前使用范围更有限的参考甲基体的研究中没有观察到。最引人注目的是，Roadmap肺样本主要由血液（40%）、内皮（34%）和平滑肌（5%）组成，只有22%的DNA来源于肺上皮细胞（图6f–i）。

图6 使用细胞类型特异性生物标记物进行片段级反褶积

总之，本研究提供了一份原始人类细胞类型的全面甲基化图谱，以及一套广泛的细胞类型特异性标记和计算工具，用于混合细胞类型样本的片段水平分析。这些数据揭示了DNA甲基化在细胞生物学和基因调控中的作用，并有助于识别每种细胞类型中的活性增强剂。也许该图谱最有前景的用途是混合细胞型样本的片段水平反褶积的潜力，允许在患有癌症和其他疾病的个体血浆中敏感地识别cfDNA的起源组织。