文献精读| PacBio测序助力斑马鱼转录组高精度注释

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导读

大家见过斑马鱼吗？

它披着美丽的深蓝色条纹，和斑马的条纹相似，因此得名。别看它个头小，不过4-6cm长，却是重要的模式生物，因为它易于繁殖，花费较少，而且最重要的是和人类基因组相似度很高（87%）。由于斑马鱼基因组注释不完整，关于其转录组的研究常常受到阻碍。在合子基因激活（zygotic genome activation，ZGA）阶段，斑马鱼转录组更是动态表达，其复杂性可想而知。在这种情况下，短读长的二代测序技术无法很好地将这种复杂性呈现出来。所以，来自西奈山伊坎医学院神经内科的研究人员利用PacBio长读长测序技术对斑马鱼ZGA阶段前后的胚胎进行全长转录组分析，获得了高精度的转录组注释结果，研究结果于2018年7月发表于Genome Research。

方法流程

研究者利用PacBio SMRT测序平台对斑马鱼ZGA时期前后的胚胎进行全长转录组测序及二代转录组测序，通过与参考序列比较分析获得了新的转录本及新的异构体。然后运用包括结构预测、序列一致性及功能守恒分析等一系列算法对这些结果进行验证，同时利用二代转录组数据进行定量。

Fig.1 斑马鱼胚胎全长转录组分析流程

研究结果
全长转录组数据分析使用GMAP将全长转录组比对到参考基因组GRCz10，研究者发现有18,777份转录本被成功比对到参考基因组上，仅有3.6%的全长转录组数据未能比对上，与短读长数据（>20%）相比要少得多。将全长转录组数据与GRCz10 RefSeq注释结果比对，发现在15,159个GRCz10 RefSeq注释的转录本中，8005个（52.8%）与全长转录组数据重叠（Fig.2）。与参考序列的高度一致性反映出该组数据的高质量，适合于进行新的转录本的鉴定。

Fig.2 全长转录本对参考转录组GRCz10的覆盖度

为了得到潜在的新型转录本，研究者首先分析了全长转录本与RefSeq转录本的结构相似性，大多数观察到的转录本与潜在的新基因或亚型相对应。结果显示，4205 (22.4%)个转录本被认为是潜在新转录区（NTR）的转录本，5295 (28.2%)个转录本是潜在的新isoforms（Fig.3）。

Fig.3 全长读转录组中潜在的新转录本

NTR区转录本进一步解析

将二代转录组数据比对到增加了NTRs的斑马鱼转录组，结果发现，短读测序数据被成功比对上，还捕捉到了斑马鱼参考基因组注释中缺失的新转录本的全部外显子结构。在经转录抑制剂α-amanitin处理和未经处理的样本中，大部分由长读测序发现的新转录本（分别为89% 和 86%）都有二代测序数据支持（TPM>1）（Fig.4）。

Fig.4 短读长数据支持新转录区

为了确定新的转录区编码蛋白质的功能，研究者分析了这些转录本的蛋白质编码潜力，与已知蛋白质序列的保守性，以及与已知蛋白质结构域的功能关系。他们使用CPAT (Coding-Potential Assessment Tool)工具验证NTRs的蛋白质编码能力，在4205个潜在NTRs中，CPAT鉴定出3255个极可能编码蛋白质的NTRs。

对于可能不编码蛋白质的NTRs，研究者通过两种方法——phyloP 算法和phastCons算法来评估它们在进化中是否存在保守性。研究者观察到，相对于随机对照区域，258个非蛋白编码NTRs转录本的保守性有所提高(24%)（Fig.5A）。

通过与Rfam数据库比对，研究者鉴定出76个匹配的长读长转录本（Fig.5B）。其中有一个特殊的NTR与Rfam数据库中的mir-548匹配，这个转录本仅存在于经转录抑制剂α-amanitin处理的样本中（该样本含大部分母源RNA），而在未经处理的样本中（该样本含大部分合子RNA），发现了一个具有较短的3’尾的该转录本的异构体。这个拥有更长的3’尾的转录本是已知的mir2189一个新的同源物（Fig.5C）。结合以往的研究结果，研究者指出，在这一对转录本中，母系转录本拥有更长的3’尾，这可能是推测的靶点，也可能是miRNA结构本身，且参与了母体向合子转变的调控过程。

Fig.5 非编码NTRs特征

新的转录异构体

为了完善的预测的新异构体列表，研究者还量化了可选剪接事件的数量，并将剪接事件类型的分布与RefSeq注释中观察到的情况进行了比较（Fig.6）。基于长读长测序数据，研究者发现了超过2000个新的可变剪接事件，可见长读长的转录组测序可以鉴定到更全面的可变剪接情况。

Fig. 6 长读长测序与参考序列中的AS事件比较

研究者使用短读长数据量化在胚胎发育早期和晚期样本中发现的新异构体，分析表明：在胚胎发育晚期，可变的3’UTR及内含子保留的可变剪接形式有所增加（Fig.7A）。接下来，研究者还利用PCR实验验证了长读长数据对mvk、tead3b、srsf7a和h3f3c等基因的可变剪接分析能力（Fig.7B）。

Fig.7 斑马鱼ZGA阶段前后的可变剪接事件（A）；PCR验证实验结果（B）

此外，研究者还发现和验证了一种跨越多个mir-430元件的新的8 kb转录本，这是胚胎早期发育的重要驱动因素。

这项研究利用长读长测序技术在转录组研究中的显著优势，解析了斑马鱼ZGA阶段前后复杂的转录组动态变化，为斑马鱼转录组提供了高分辨率的注释资源。

PacBio的全长转录组测序技术为研究者提供了一个可以全面观察转录组动态变化的机会——无需拼接，直接获得转录本全长，可获得更多被二代短读长数据遗漏的novel 基因及isoforms，更真实地反映转录组全貌，这将为转录组学研究带来更多新的机遇。

2018自然指数更新！未来组&希望组榜上有名

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近期，Nature Index网站更新了2018年最新的自然指数排名（统计自2017年10月1日至2018年9月30日）。组学君查询了生命科学领域中国科研机构的榜单，不禁感慨我泱泱中华真是人才辈出啊~话不多说，上表！

生命科学领域中国高校前20名

过去一年，依托于三代长读长测序分析平台及出色的生信分析团队，武汉未来组和北京希望组也取得了不错的成绩：在生命科学领域中国科研机构榜单上，未来组位列第171名，希望组位列第237名。

未来组

2018年4月，未来组与新加坡国立大学等单位合作，在Develomental Cell杂志发表了国内首篇应用三代测序技术完成的拟南芥全基因组甲基化修饰（6mA）的文章，解析6mA在拟南芥中的分布模式和潜在功能（未来组项目经验丨国内首篇应用三代测序技术直读真核生物甲基化修饰（6mA）文章在线）

2018年7月，未来组与中国农业大学农业生物技术国家重点实验室及国家玉米改良中心等单位合作，在Nature Genetics上发表了重要玉米品系Mo17的高质量参考基因组，揭示玉米种内广泛的遗传变异，并发现了种内特有的基因顺序及基因结构变异可能对杂种优势和基因组进化产生影响（Nature Genetics | 三代测序揭示玉米种内存在广泛的基因结构变异）

希望组
2018年7月，希望组与中山大学中山眼科中心等单位合作，在Molecular Cell杂志发表了首个中国人DNA  N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰图谱，揭示了DNA 6mA甲基化修饰在人类基因组中的调控机制（重大突破| 三代测序助力人类基因组DNA 6mA甲基化研究）

未来组&希望组将继续优化服务方案，为广大合作伙伴提供优质、高效的技术服务。助力科研，我们用实力说话！

附表一 未来组已合作发表三代测序相关文章列表

附表二 希望组已发表文献列表

关于自然指数自然指数（Nature Index）是依托于全球顶级期刊（2014年11月开始选定68种，2018年6月增至82种），统计各高校、科研院所（国家）在国际上最具影响力的研究型学术期刊上发表论文数量的数据库。运用这个数据库，可以根据各机构的论文发表数量及类别来进行排名和期刊索引，这一数据库的实时在线版免费为公众开放。
NatureIndex查询链接：https://www.natureindex.com/institution-outputs/generate/Life%20Sciences/countries-China/All/score

翘首未来丨聚焦准确度，Oxford Nanopore 火力全开

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通过之前的了解，我们已经知道Nanopore测序主要依赖于合成聚合物膜上的纳米孔，DNA/RNA链通过纳米孔时，产生电流信号，经base call可转化为碱基序列信息。从DNA/RNA链转换为碱基序列的过程中，化学试剂、测序模式、base call的准确度等方面都将影响到最终的碱基质量值（碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，质量值Q越高代表碱基被测错的概率越小）。Oxford Nanopore Technologies(以下简称ONT)公司对于这些方面也做了一系列的开发和优化。在近日的Nanopore科研团体大会（NCM2018）上，Oxford Nanopore首席技术官Clive G Brown在会上展示了ONT团队针对Nanopore测序仪用户最关心的准确性问题做出的努力及研发成果，一起来看看在提升准确度方面ONT团队到底做了哪些升级吧~


图1 Nanopore测序示意图

从R9.4.1到R10

R9.4.1版纳米孔是目前Nanopore测序通用版本，有一个纳米孔通道，一个read head。R10 是一种新型的纳米孔，其纳米孔通道更长，具有两对Reader heads（图2）。这意味着可以产生更多的碱基控制信号以达到更高的准确度。在内部测试中，以75×覆盖度，新的R10纳米孔碱基质量值可超过Q40。ONT研发团队已开始着手于R10的测试工作，并发现了其中需要提升的部分。R10试剂有望在2019年早期公开发布。


图2 R9.4.1与R10版纳米孔

新的basecaller:flip-flop

这个基于flip-flop算法的basecaller软件同时适用于R9和R10版本试剂的测序数据，使用flip-flop重新识别现有数据（R9数据），碱基质量值可达到Q37。甲基化分析也被整合到了其中，现在已经允许使用R9.4进行5mC (CpG)的识别。这个软件将在12月中旬通过Guppy软件发布。ONT公司目前正在进行R10版本的工作，预计质量值可提升至Q42。用户可以通过http://bit.ly/2Q0EApc访问新碱基识别软件。

Linear Consensus Sequencing (LCS)测序模式

Clive勾勒了一个新的名为线性一致性测序（LCS）的方法。这种方法将一条链的数条拷贝结合在一起，通过一条读长进行测序，以获得更高的准确度。LCS测序模式保留原始模板链，可检测到链上的碱基修饰信息。

图3 线性测序Linear Consensus Sequencing (LCS)

8B4文库制备方法

8B4是一种新的文库制备方法，一个提升准确性的新文库制备方法可获取更丰富的信号。ONT公司目前正在精调8B4的碱基识别和共有序列方法。

1D2建库测序方式

1D2测序模式对DNA的两条链均进行了测序（图4），在保留碱基修饰的同时，提高单碱基准确率。1D2建库测序方式的更新将单条read准确度提高到了98%。新的1D2化学试剂含有带独特识别器（unique pairing identifiers, UPIs）的连接接头，支持用于扩增子测序。

图4 1D与1D2测序

ONT的这些更新将极大地提升Nanopore测序的准确性及碱基修饰的识别能力，使Nanopore测序的应用范围更加广阔，Nanopore测序技术将在动植物基因组组装、微生物基因组、全长转录组、结构变异检测及病原菌检测等领域具备独一无二的优势。

（内容整理自OxfordNanopore微信公众号）

参考链接：
https://mp.weixin.qq.com/s/ooZbJzsuAaeQQdBnN5lozg

未来组邀您参加第三届国际植物和农业科学研讨会

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第三届国际植物和农业科学研讨会将于2018.12.15-12.18在福州三迪希尔顿酒店召开。本次会议由国际植物和农业科学研讨会委员会主办，福建省海峡植物应用系统生物学重点实验室、福建农林大学海峡联合研究院、福建农林大学作物科学学院和福建农林大学植物保护学院联合承办。《国际植物和农业科学创新研讨会》是加拿大萨斯喀彻温大学Takuji Tanaka教授于2016发起的，旨在探讨植物科学和农业科学研究领域的最新创新性研究进展，通过学术研讨促进与会人员之间的科研交流，推动参会单位之间的深层次交流与合作。来自五个国家的39位特邀报告人(中国13人，日本11人，孟加拉8人，加拿大6人，美国1人)将就植物科学和农业科学领域研究成果、进展动态、发展方向进行研讨和交流。

未来组将携最新的PacBio SMRT、Oxford Nanopore、BioNano光学图谱和Hi-C染色体构象捕获等技术前来参加本次研讨会，并展示基于长读长测序动植物基因组组装，基于三代测序的微生物研究等最新进展及应用成果。欢迎莅临11号未来组展位，期待与您共同探讨基因组学的新技术。

会议链接：http://www.fafu-ipfs.com/

国家农业基因组科技创新联盟总结会成功召开

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2018年12月13日，国家农业基因组科技创新联盟（简称“联盟”）总结会于深圳完美闭幕，此次会议以“大科学计划、优势互补、互利共享、成果共享”为主题，由国家农业基因组科技创新联盟和中国农业科学院深圳农业基因组研究所联合主办，由武汉未来组生物科技有限公司承办，是“联盟”成员共享农业基因组学硕果、共商农业科技创新战略的盛事。

“联盟”成立于2017年，由农业部主导，由国家级、省级农业科研教学机构、现代农业龙头企业共80家单位组成，含中国农业科学院、中科院、北京大学、十多个省级农科院等成员，着力解决农业基因组学发展中全局性重大战略与共性技术难题，开展农业基因组科技协同创新的合作组织，各级农业行政主管部门对联盟开展科技创新和成果推广提供业务指导和支持等。近日武汉未来组也受邀加入“联盟”，参与共建工作。

本次会议由中国农科院基因组所黄三文所长主持，中国农科院基因组所骆建忠书记、科创委和经信委领导等分别致辞，黄三文所长、钱万强助理和阎萍老师详细介绍了联盟情况、合作单位和扶贫单位等，且由与会成员分享了各自在农业基因组学、农业分子育种、农业和食品宏基因组等领域的成果。“联盟”在农业生物组学基础、基因组学与动植物育种、基因组学与动植物健康三大学科领域取得突出进展，“联盟”成员对于国家农业科技的创新应用提出了各自的规划和展望。

未来组基于长读长（Nanopore/Pacbio)单分子实时测序技术，解决了动植物基因组组装中高杂合度、高重复区域、异常GC含量等诸多难题，大大提升组装连续性，重新定义ContigN50、ScaffoldN50交付指标。在细菌基因组研究领域，未来组基于Oxford Nanopore平台充分发挥了超长读长的优势，轻松跨越细菌基因组中的重复与复杂区域，实现了对DNA碱基修饰的直接分析，使组装简便快捷。同时，未来组搭建的Pacbio Sequel测序平台可读取多圈全长扩增子，获得准确度无限接近1的环状一致性序列，进而真实反映微生物群落和菌群的组成。最新出炉的PacBio System 6.0数据以及Nanopore PromethION数据均处于行业优势水平，研发的Ultra long reads最长读长超过1Mb,基于超长读长测序和超算平台，一天可完成一个动植物基因组组装。基于PacBio SMRT、Oxford Nanopore、BioNano光学图谱及Hi-C染色体构象捕获等技术平台并搭载天河二号和阿里云等高性能集群，未来组解决了动植物基因组、微生物基因组、全长转录组及微生物群体研究等领域的技术瓶颈，推动了基因组学研究的升级换代。同时，未来组将继续开拓创新，继续开发基于三代测序技术的全新算法流程，进一步压缩动植物、微生物及宏基因组等的组装分析周期，为高校及科研院所等提供高效、准确、可靠的科研服务。

【2018年末精选】值得一看的三代基因组文章（植物篇）

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从2000年第一个植物基因组拟南芥被破译以来[1]，近20年里有300多种植物被相继测序并发布，覆盖了各种粮食、油料、蔬菜、药用及果类作物。已知植物基因组从几十Mb到一百多Gb不等，其多倍性、高杂合以及多重复区域的特点常常让小伙伴们感到荆棘遍地，举步维艰。前段时间，整理了中药基因组的文章，今天再为您奉上2018年发表的植物基因组高分文章思路，助您新的一年披荆斩棘，在科研的道路上昂首阔步！

文章给出了105种已发表的基因组的组装对比，用事实证明了基于第三代测序技术平台在植物基因组组装上的显著优势。

玫瑰是重要的观赏性植物，具有很高的的文化和经济价值。法国里昂大学的研究人员完成了首个玫瑰全基因组的测序组装，并通过对几个主要玫瑰品种的重测序分析对玫瑰的起源及驯化历史提出了新的见解。

玫瑰基因组高度杂合，其基因组组装极具挑战性。法国里昂大学的Bendahmane研究组开发了一种体外培养方案，从源自中国的杂合二倍体玫瑰品种Rosa chinensis中获得了一个纯合子，用三代长读长PacBio SMRT测序和Hi-C染色体构象捕获技术获得了首个高质量玫瑰基因组。基因组的多样性分析揭示了同时具有强生长活力和反复开花的中欧杂交品种“La France”的起源之谜。研究者从Rosa chinensis的基因组片段中发现了新的与反复开花相关的候选基因。通过重建调控和次级代谢途径，研究者提出了一种与花香和花色相互关联的调控模型。

玫瑰基因组的发布为理解玫瑰性状的调控机制提供了基础，并将加速玫瑰、蔷薇科植物和观赏植物的品种改良。

小麦是人类重要的食物来源，获得其基因资源并对其遗传多样性和关键性状分析将是实现小麦高产增收的重要途径。

中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室等单位合作完成了小麦A亚基因组的测序和染色体序列精细图谱的绘制。该研究结合了BAC建库方法，三代PacBioSMRT技术、Bionano光学图谱技术和10X genomics技术，成功绘制了小麦A亚基因组的精细图谱，绘制出了小麦A亚基因组7条染色体的序列图谱，注释出了41,507个蛋白编码基因。

研究发现在小麦基因组中参与春化和开花的REM类转录因子基因有明显扩增。通过与水稻、高粱和短柄草基因组的比较和共线性分析，推演出了小麦A亚基因组7条染色体的进化模型，并鉴定出了小麦A亚基因组从二倍体，经四倍体到六倍体进化过程中的染色体结构变异。

此次科学家描绘的小麦 A 基因组图谱，将有力地促进小麦基因组学研究和小麦分子设计育种的开展。这项研究也体现了长读长测序技术及光学图谱技术在使基因组更完整、更精细、更准确上的重要应用价值。

中国农业大学农业生物技术国家重点实验室及国家玉米改良中心联手武汉未来组、斯坦福大学及冷泉港等团队合作，公布了一个重要玉米种质的高质量参考基因组，并发现了种内特有的基因顺序及基因结构变异可能对杂种优势和基因组进化产生影响。

该研究通过将三代PacBioSMRT测序技术、二代Illumina测序技术与BioNano光学图谱技术结合，获得了一个高质量的Mo17的参考基因组，给予了一个能够广泛比较玉米种内基因组多样性的前所未有的机会。

该研究利用三代测序技术揭示了玉米种间存在的大量非共线性基因、种内基因组结构变异及基因差异表达等，这些因素可能是造成玉米世系特异性的重要原因之一，因此评估这些非共线性基因对农业性状定量表型变异的影响将是未来一个很有价值的研究方向。

2018年10月，罂粟基因组在著名科学杂志Science上发布，一度引起轰动。该研究公布了罂粟基因组草图，组装中运用了Illumina、10Xgenomics及PacBio测序数据，并使用Nanopore和BAC数据辅助验证组装质量，最终contigN50为1.77Mb，scaffoldN50为204 Mb。

研究者将罂粟基因组与葡萄、拟南芥、阿拉伯咖啡、莲和耧斗菜等双子叶植物基因组进行比较分析，探索罂粟的演化历程。研究发现，罂粟基因组在距今780万年前发生了一次全基因组加倍事件。

罂粟基因组为研究者提供了一个可以定位与BIA代谢相关基因的机会——位于11号染色体上的一个584kb的区域内，排列着诺斯卡品基因簇、(S)- to (R)- reticuline (STORR)基因及四个吗啡生物碱合成途径相关基因，这些基因在茎中共表达合成吗啡，也称为BIA基因簇。研究发现，基因组重排在罂粟中BIA代谢的进化中起重要作用。

现代甘蔗是一种多倍体种间杂交种，同时具有Saccharum officinarum的高含糖量及Saccharum spontaneum的强抗逆性、抗病性和再生能力。甘蔗基因组大而复杂，其组装是一项世界性技术难题。

福建农林大学明瑞光教授团队应用BAC技术、Illumina、PacBio长读长测序技术及Hi-C染色体构象捕获等技术，首次完成了对单倍体S. spontaneumap85-441(1n = 4x = 32)的基因组测序，完成了32条模拟染色体的组装。通过两轮MAKER分析及人工注释，研究者鉴定出了甘蔗基因组中的35,525个等位基因。与高粱相比，S. spontaneum的基本染色体数目从10条减少到8条，这是由2条祖先染色体分裂引起的。通过基因组内部比较分析，证实了S. spontaneum发生了两次间隔较短的全基因组复制事件。研究者还鉴定了与甘蔗中C4光合作用途径、糖转运途径、抗病性等相关的关键基因。

该研究攻克了同源多倍体基因组拼接组装的世界级技术难题，率先破译甘蔗S. spontaneum基因组，同时还解析了甘蔗割手密种的系列生物学问题，特别是揭示了甘蔗属割手密种的基因组演化、抗逆性、高糖以及自然群体演化的遗传学基础。

菊属植物种类繁多，又含多种栽培种，兼具观赏和药用价值，且染色体组结构从2n=18到8n=72之间，十分复杂，多年来难以攻破。

中国中医科学院中药研究所所长陈士林研究员及副研究员宋驰博士等利用ONT平台解析了可能代表栽培菊属祖先基因组的二倍体菊花脑基因组，分析表明其演化受重复序列爆发和近期WGD事件的驱动，该基因组复制事件在约38.8个百万年前将菊属和向日葵分化开来；菊花脑观赏及药用性状的变异与包含旁系同源基因组复制事件的基因组家族扩张有关。对菊花脑中扩张的基因家族进行功能注释，发现这些基因功能集中在转移酶活性和萜烯合酶活性等方面，表明这些基因可能与次级代谢产物的生产有关。

研究者还绘制出与重要生物学特征基础通路相关基因的完整编目并分析了参与黄酮类和萜类化合物合成的基因。研究鉴定出了类萜合成酶（TS）基因和多个细胞色素P450依赖的加氧酶（CYP）基因，令人惊讶的是，除了那些已经在其他已测序的真双子叶植物中鉴定出的TS/CYP组合之外，研究者还在菊花中发现了新的组合，如TPS-a/CYP99和TPS-g/CYP79/CYP76等。

2018年发表的三代植物基因组文献（PacBio）

2018年发表的三代植物基因组文献（Nanopore）

参考文献

1. Initiative A G . Analysis of the genome sequence of theflowering plant Arabidopsis thaliana.[J]. Nature, 2000, 408(6814):796-815.

2. Belser C，IstaceB， Denis E, et al.Chromosome-scaleassemblies of plant genomes usingnanopore long reads and optical maps. NaturePlantsvolume 4, pages879–887(2018)

3. Raymond, O. et al. The Rosa genome provides newinsights into the domestication of modern roses. Nature Genetics 50,772-777 (2018).

4. Ling, H.-Q. et al. Genome sequence of theprogenitor of wheat A subgenome Triticumurartu.Nature 557, 424-428(2018).

5. Sun, S. et al. Extensive intraspecific gene order andgene structural variations between Mo17 and other maize genomes. NatureGenetics (2018).

6. Guo L , Winzer T , Yang X , et al. The opium poppy genomeand morphinan production[J]. Science (2018).

7. Zhang, J. et al. Allele-defined genome of theautopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L.Nature Genetics 50, 1565-1573(2018).

8. Song C., et al. The Chrysanthemum nankingense genome provides insights intothe evolution and diversification of chrysanthemum flowers and medicinaltraits. Mol. Plant(2018). 

强强联手 | 希望组&未来组与华为深度交流并签署战略合作协议未来

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导读    
2018年12月6日，华为技术有限公司（以下简称“华为”）与北京希望组生物科技有限公司（以下简称“希望组”）&武汉未来组生物科技有限公司（以下简称“未来组”）在华为北京研究所举行合作协议签约仪式。华为云中国区总裁洪方明先生和希望组&未来组CEO汪德鹏先生等共同出席签约仪式，并见证双方代表签署合作协议。同时，双方分别进行了参观交流，对合作伙伴的现状和发展有了更深一步的了解。

当天上午，华为云中国区总裁洪方明先生一行来到希望组北京总部进行实地参观，希望组&未来组CEO汪德鹏先生就公司的概况、三代测序仪的运行情况、公司近年来蓬勃向上的发展态势以及未来全面拓宽渠道的发展方向进行了详细介绍。在参观的过程中，大家都惊叹于第三代测序技术的飞速发展，也高度赞扬了希望组&未来组致力于推动人类健康事业和基础研究发展的企业精神。

随后，大家驱车来到华为北京研究所。首先参观了华为北京研究所极具现代风格的展厅，了解以第五代移动通信技术为核心的各种通讯、物联网解决方案和产品，包括全球领先的宽带网络、智慧城市，最尖端的服务器、路由器，以及智能电脑等终端产品。同时重点介绍了华为云EI开发平台ModelArts，该平台包括数据标注准备、模型训练、模型调优、模型部署等功能，为人工智能应用开发提供一站式服务，从而可以让开发者更快上手，进行训练和部署，为各行各业人工智能应用带来突破性的发展。

在签约仪式上，双方领导深入探讨了在各自领域的战略布局、资源及产品优势，并就未来在信息技术与基因测序领域展开全方位深度合作达成一致。双方发展思路和价值观具有高度的契合性，同时双方战略布局具有较强的互补性。此次建立合作伙伴关系，将充分发挥华为云在计算、存储、网络等领域的技术优势，利用希望组&未来组三代测序平台和产品，努力攻克技术壁垒，通力打造适用三代测序技术的智能化平台。

华为云中国区总裁洪方明先生表示：华为云的品牌口号是“有技术、有未来、值得信赖。”首先，华为云有自己的独创技术，有很多在业界处于领先地位。第二，华为云的“未来”不仅仅是推动客户的业务发展，更多的则是与客户共同成长，一起创新，一起面向未来。而在“值得信赖”的问题上，华为始终坚持“三不”原则，即“上不碰应用、下不碰数据、不做股权投资”，希望与希望组&未来组一起实现“产品平台化、平台行业化、能力服务化”。

希望组&未来组CEO汪德鹏先生表示：希望组&未来组始终秉持“科学的边界、技术的极限、伦理的底线、人文的关怀”四个重要的发展理念。此次强强联合，既是双方整合优质资源，提升自身竞争力的重要举措，也是双方拓展业务渠道、共同开发市场从而实现合作共赢的必然选择。双方不仅携手共开信息技术在三代测序平台应用之先河，同时也促进了信息技术和测序技术在医学、动植物等领域的发展，共同探索生命奥秘，让生命充满希望！

RNA修饰？APA分析？isoform分配？Nanopore direct RNA一招搞定！

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高通量cDNA测序技术极大地提高了我们对转录组复杂性和调控机制的理解。然而，由于经历了反转录过程，天然RNA中所包含的修饰信息往往无法通过cDNA测序获得。可喜的是，基于纳米孔测序的Nanopore平台恰恰可以实现对天然RNA分子的测序，不经反转，无需扩增，同时可以记录RNA链上的碱基修饰信息，真实反映个体转录本的原始信息。组学君今天要和大家分享的是，direct RNA测序如何在人类转录本中的RNA修饰、APA分析及isoform等位基因分配中大展拳脚。
Nature Methods: Direct RNA测序方法测评[1]

Nanopore平台对天然RNA测序的方法测评文章在今年年初正式发表，详细介绍了Nanopore平台在对酵母转录组进行direct RNA测序中的应用，并给出了direct RNA测序的文库制备流程（Fig.1a）。

Figure 1 (a) Direct RNA-seq文库的制备方法；（b）一个转录本通过纳米孔引起的电流信号

此外，文章还指出direct RNA测序还可以从测序信号中直接读取样本的可变多聚腺苷酸化信息（Fig.1b）和碱基修饰信息（Fig.2）。

Fig. 2 合成RNA链上的碱基修饰检测

Direct RNA测序是一种高度平行的、实时单分子测序方法，绕过了反转录和扩增步骤，可获得全长、链特异性的RNA序列，并能直接检测RNA中的核苷酸类似物。

bioRxiv: 人类天然poly(A) RNA转录组测序[2]

来自约翰霍普金斯大学的研究者利用Nanopore测序技术完成了对人GM12878细胞系中的天然poly(A) RNA分子的直接测序，其研究论文已经预印。通过结合高准确度的二代Illumina测序技术，该研究共鉴定了78,199个高置信度的异构体。同时，研究者提出了基于Nanopore RNA测序技术进行3’端poly（A）尾长度的评估、碱基修饰检测及isoform等位基因分配的策略。

方法流程

Fig.3（a）Nanopore天然poly(A) RNA测序流程；（b）具有代表性的2.3 kb TP3 转录本在Nanopore测序中引起的电流信号；（c）数据分析流程

Isoform鉴定

长读长的天然RNA测序可以发现用短读cDNA测序方法难以观察到的RNA异构体。通过结合Nanopore与Illumina平台数据，研究者在GM12878细胞系中发现了65.3%的新的转录本类型，这些在GENCODE v24中是注释不到的。值得注意的是，Nanopore poly (A) RNA数据集检测到的异构体数量没有达到饱和，表明需要更大的测序深度才能全面描述GM 12878 poly(A)转录本(Fig.4)。

Fig.4GM12878天然poly（A）RNA的isoform水平分析

等位基因特异isoform鉴定
理论上Nanopore RNA测序产生的长读序列应该更容易地分配给亲本的等位基因，因为遇到杂合子的SNP的可能性更大。研究者利用HapCUT2将至少包含两个杂合子变异体的reads分配给他们的亲本等位基因。研究者在这些数据中挖掘出34个有两种isoform形式的基因，这些基因中>80%的reads以一种isoform形式表达，来源于一个等位基因；而另有>80%的reads以另一种isoform形式表达，来源于另一个等位基因。例如其中的IFIH 1基因，父系isoform中第8外显子保留，而母系isoform不包括第8外显子（Fig.5）。

Fig.5IFIH 1基因isoform结构

IFIH 1在分配给母系和父系等位基因上的reads大致相等，但母系isoform不包含第8外显子(绿色框)。

Poly(A)尾长度鉴定

研究者建立了一种计算方法——nanopolish-polya，用来评估转录本中的poly(A)尾长度。采用poly(A)尾分别带有10、15、30、60、80和100个A碱基的合成RNA分子进行nanopolish-polya的测试，评估结果见Fig.6a。该方法也存在一定的局限性，当poly(A)区域在链转换过程中在纳米孔中的停留时则无法准确估算，有可能会造成错估（1-3%的概率会发生），且随着poly(A)尾长度的增加，方差也随之增大。

将nanopolish-polya应用到GM12878转录本中，发现Poly(A)尾的长度主要集中在50nt左右，部分转录本拥有更长的poly(A)尾。而线粒体的转录本的poly(A)尾长度集中于52nt左右，基本不超过100nt（Fig.6b）。

Fig.6nanopolish-polya的测试及应用

碱基修饰检测

核苷酸修饰会影响RNA的结构、局部电荷和碱基对电位，从而改变其与蛋白质结合的亲和力。m6A是mRNA中常见的修饰形式。研究者利用现有的免疫共沉淀研究来确定Nanopore poly(A)RNA测序数据中可能含有m6A的基因。将真核细胞伸长因子2(EEF2)的RNA在m6A位点上的原始电流信号与从GM 12878 mRNA产生的体外转录信号进行比较，证实了离子电流的变化是由m6A引起的（Fig.7a）。为了进一步验证这一结果，研究者设计并合成了GGACU METTL3模体中的29个碱基的寡核苷酸序列，包含了m6A修饰和未修饰的腺苷酸（Fig.7b）。Nanopore测序数据显示出来明显的区别(Fig.7c)，与EEEF2的结果一致。

Fig.7 RNA碱基修饰检测

文章指出，Nanopore RNA测序具有两个明显的特征：一是被测序的RNA链依然保留着其在细胞中的天然结构，能够检测到转录后的修饰如碱基修饰和多聚腺苷酸化修饰等；二是读长足够长，可以达到数千个碱基。这种组合具有独特的优势，很可能为RNA的生物学研究带来新的见解。

[1] Garalde D R, Snell E A, Jachimowicz D, et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods,2018.

[2] Workman, R.E. et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly(A) transcriptome. bioRxiv (2018).

第七届全国微生物基因组学学术研讨会圆满落幕

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2018年12月3日，第七届全国微生物基因组学学术研讨会在江西南昌圆满闭幕。此次会议由中国微生物学会农业微生物学专业委员会和中国微生物学会普通微生物学专业委员会联合主办，来自国内微生物领域的专家学者及各有关高校、科研机构的科研学术代表共200余人欢聚一堂，窥视微生物组学的奇妙。

12月1日上午，全国微生物基因组学2018年第七届学术研讨会隆重召开，农业微生物学国家重点实验室副主任孙明教授主持开幕式，中国微生物学会理事长邓子新院士致开幕辞，随后，江西省科学技术协会梁纯平副主席，江西师范大学校领导，江西省微生物学会理事长魏华研究员分别致辞。致辞结束，大家合影留念。

会议开始，林敏研究员、向华研究员等率先作了报告，随后何正国教授则汇报了对分枝杆菌生长调控及逆境存活机制的研究，陈实教授则展示了微生物基因组磷硫酰化修饰的特征挖掘，等等。12月2日，李越中教授、孙明教授、朱笃教授、徐振江教授以及裘梁博士等也陆续分享了各自研究领域的成果。

未来组生物科技有限公司微生物研发经理樊俊鹏博士以“三代测序在微生物基因组学研究中的应用”为主题做了精彩演讲，重点介绍了第三代测序技术在微生物基因组组装、表观遗传分析方向上的优势。未来组推出的万种细菌基因组项目正在如火如荼的进行中，基于Oxford Nanopore等第三代测序平台，单日数据通量达1.6T，因此细菌基因组完成图的价格也低至3000元/株，目前未来组更是开发了完善的数据分析流程，搭载华为云平台实现5个工作日即可交付分析结果。


高性价比的分析服务吸引了众多场内外的关注。会场外，未来组生物科技有限公司携带的基于ONT平台细菌基因组研究、全长16S/18S/ITS/功能基因扩增子研究、宏基因组3.0最新进展及应用成果反响热烈，众多专家学者前来热烈交流讨论。

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南京再会|2018中国遗传学会圆满落幕

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2018年中国遗传学会第十届会员代表大会暨学术讨论会于11月29日在南京国际青年会议酒店圆满落幕，此次由中国遗传学会主办的大型会议以继承、创新、发展为主题，吸引了近千名遗传学相关领域的专家学者与会交流遗传学的热点、难点等，并一起庆祝遗传学会成立四十周年，共襄盛事。

会议于11月27日上午8：30准时开幕，江苏省人民政府副省长陈星莺、中国科学技术协会副主席沈岩、南京农业大学校长周光宏、中科院遗传与发育生物学研究所党委书记胥伟华先后致辞，肯定了中国遗传学会对中国科研事业的巨大贡献并表示遗传学会将继往开来、奋发图强，迎接硕果累累的明天。随后，中国遗传学会理事长张亚平院士总结了遗传学会的工作并汇报了2018年度的财务情况。

10点左右，中国遗传学会会员开始了换届改选，随之选举投票产生了第十届理事会成员和第十届理事会党委会。接着，会上播放了《生命之光》纪念视频，回顾了中国遗传学会四十年来的艰辛历程，然后大会的学术报告正式开始。由中国工程学院曾溢滔院士作的《中国遗传学的春天——纪念中国遗传学会成立40周年》报告引得全场掌声雷动，紧接着由贺林院士、季维智院士、杨瑞馥研究员、周斌研究员、王文研究员等等相继作的报告不仅讨论了医学、生物医学研究的现状和未来，也探索了细菌群体遗传学、遗传示踪新技术、脑血管发育、动物进化基因组等学术研究的进展和前景，精彩内容引发与会人员的共鸣与喝彩。

28日，植物遗传、动物遗传、人类与医学遗传、发育遗传学、表观遗传学、青年论坛、生物信息学与临床决策支持、遗传学教育与科普、微生物遗传、神经遗传学、遗传与分子诊断、科学道德与伦理共十二个分会场拉开帷幕，百家争鸣，精彩纷呈。未来组&希望组CEO汪德鹏先生受邀与会并就第三代测序技术在遗传学领域中的应用和行业人员展开了热烈的讨论并深入交流了遗传学领域的热门问题，强调了伦理道德在科学研究中的约束规范作用。武汉未来组生物科技有限公司秉持“技术的极限、科学的边界、人文的关怀、伦理的底线”四个重要的发展理念，坚持科学技术和人文伦理不可分割，技术在正确的人文观念引导下为人类生活带来改变才是健康、科学的发展观。

未来组与希望组的与会成员在会后吸引了众多专家学者前来热烈交流讨论第三代测序技术在动植物分子育种、精准医疗上的应用和优势，并分享了Oxford Nanopore以及PacBio技术最新的进展。第三代测序技术因其单分子实时测序、长读长、高保真度等特性闯入研究者们的视野，因在人和动植物、微生物研究中的卓越表现逐渐获得了国际顶级期刊的认可；目前未来组的三代测序技术无论在通量还是读长上都具有显著的优势，并搭载华为云、阿里云等高性能集群，发表了华夏一号基因组、玉米种内基因结构变异、人类基因组DNA m6A甲基化、拟南芥甲基化以及木棉、水稻、杜仲、莲、萤火虫基因组和棉花、矮牵牛等全长转录组一系列高质量的文章。随着三代测序的价格逐渐下降，未来组将厉兵秣马、开拓创新，继续开发基于三代测序技术的全新算法流程，为动植物、微生物及宏基因组等的组装、转录组分析等提供高效、准确、可靠的方法手段，为合作伙伴的研究加油助力。