结构变异（Structural variants，SVs）通常是指基因组上大长度的序列变化和位置关系变化。研究表明，与单核苷酸多态性(SNPs)相比，SVs可以解释更多的表型变异。在植物基因组中，SVs的类型、大小以及对于表型的贡献多有报道，大概1/3已报道的作物表型是由于结构变异引起的（Gaut et al. 2018 Nature Plants），但是对于SVs在种群个体间的分布以及种群动态，人们知之甚少。希望组科技服务在6月份推出了基于Nanopore平台的三代测序群体基因组SVs研究，许多老师对这一研究非常感兴趣，但苦于没有研究思路。最近，Nature Plants杂志在线发表了一篇群体水平结构变异研究文章，加州大学Irvine分校周永锋博士为第一作者，Brandon Gaut教授（UC Irvine）和Dario Cantu教授（UC Davis）为共同通讯作者。该研究探讨了葡萄驯化过程中结构变异的群体遗传学，今天就给大家分享一下这篇文章的研究策略，给各位提供一些科研灵感。
研究背景
多年生植物栽培葡萄（Grapevine）是由其野生祖先欧亚葡萄（Eurasian grapevine），在约8000年前的高加索地区驯化而来。驯化提高了果实含糖量，增大了果实的体积和串大小，改变了种子形态，同时使雌雄异株转变为雌雄同体无性繁殖。无性繁殖作物处于永久性杂合状态，并随着时间累积体细胞突变(Zhou et al. 2017 PNAS)。理论上，雌雄同体葡萄可以自交，但实践中，其自交后代无法存活，可能是近亲繁殖暴露了杂合状态下的有害等位基因。因此，大多数葡萄品种是远源亲本之间的杂交种，加上体细胞突变的积累，导致葡萄品种往往是高度杂合的。本研究通过调查野生和驯化葡萄中SV的群体遗传来填补我们对植物基因组进化认知的空白。
研究策略
无性系繁殖葡萄基因组中肆虐的半合子状态
研究者首先利用三代测序+二代测序+Hi-C技术，组装了高杂合葡萄霞多丽品种的基因组序列，并对其进行了注释和评估，发现无性系繁殖葡萄基因组中有七分之一（~15%）的基因属于半合子，这一结果在黑比诺（PN40024）基因组与赤霞珠（Cab08）参考基因中得到了验证。
随后研究者用长、短reads比对和全基因组比对等方法，综合比较了Char04和Cab08两基因组之间的SVs。结果表明利用长reads比对检测到59,913个SVs，其中75%得到另外两种方法的证实。两个品种之间有近5%的PAV基因差异，半合子基因差异高达25%，表明葡萄品种之间显著的结构变异（图2）。
图2 高杂合Char04及与Cab08结构变异的比较
SVs群体遗传分析
为了获得更广泛的葡萄品种及其野生亲缘SVs信息，研究者收集了有代表性的50个栽培葡萄品种和19个野生亲缘品种的短读长测序数据。以Char04为参考基因组，以Char04和Cab08综合比对的交叉SVs集合为金标准，获得了一组高度筛选的481,096个SVs。
随后，研究者利用上述SVs集合计算了12个野生种和12个栽培种的SFS（图3），推断了对SVs类型的选择强度，并对比了驯化和野生祖先之间的SVs频率。结果非同义SNP（nSNP）和SVs都经历了强烈的纯化选择，不同SVs类型中，易位TRAs和倒位INVs的选择性更强。因此SVs事件比nSNP更有害，INV和TRA事件尤其有害。
图3 处于强烈净化选择中的有害SVs
SVs在无性系繁殖体中积累
研基于SNP的个体杂合度分析，栽培葡萄个体杂合度要高出野生型葡萄11%，相应的单个栽培种SVs比野生种高出6%，但纯合子SVs或推测为中性的sSNPs没有明显增加（图4a)。因此有害SVs在无性繁殖情况下以杂合隐性形式隐藏、积累。
杂合变异的积累会影响连锁不平衡(LD)，通过测量SVs、SNP和组合数据集的LD随物理距离的下降来分析SVs的种群频率。结果发现，与野生品种相比，栽培品种的LD下降速度更快；与SNP相比，SVs的LD下降更快；下降速度最快的是SV+SNP数据集。表明由于有害影响，SVs通常比SNP的种群频率更低。
图4 葡萄驯化相关SVs的群体遗传学
大的，独立的倒位对浆果颜色的影响
通过计算固定指数(FST)来估计SNP和SVs在基因组中的差异(图4c)，在2号染色体上发现了两个异常值分别与性别决定和浆果颜色相关。其中对浆果颜色相关区域的进一步研究发现，在霞多丽中有一个4.82Mb的倒位(图5b)，并有证据支持白浆果的独立起源通常是由这种倒位介导的(图5d)，其导致了半合子状态的花青素合成基因MybA1和MybA2的等位基因空缺。
图5 与白色浆果相关的染色体倒位
小结
本研究首先组装了高杂合葡萄霞多丽的基因组序列，评估了该基因组中SVs类型和分布以及导致遗传半合子的SVs。随后将霞多丽与赤霞珠基因组进行综合比较，获得了一套种间SVs标准集，并以此指导、推断栽培葡萄及其野生祖先群体样本中的SVs。然后利用获得的群体SVs数据集，推断不同类型变异的选择强度，探讨了在栽培葡萄上由异交向无性繁殖转变的效应，最后研究了栽培葡萄与其野生祖先之间SVs差异特别显著的与浆果颜色相关的基因区域。 在结构变异的研究中，最首要的任务是获得到研究对象全面、准确的SVs集合，本研究中作者为了获取准确的SVs集合，利用三代测序组装了霞多丽基因组，采用长读长比对来鉴定SVs，基因组比对和短读长比对进行验证，短读长仅检测到长读长比对检测数量的62%，长读长检测的SVs中75%得到另外两种方法的验证。可见相比短读长利用三代测序检测的SVs更加全面准确。
参考文献：
Gaut B S, Seymour D K, Liu Q, et al. Demography and its effects on genomic variation in crop domestication[J]. Nature plants, 2018, 4(8): 512.
Zhou Y, Massonnet M, Sanjak J S, et al. Evolutionary genomics of grape (Vitis vinifera ssp. vinifera) domestication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114(44): 11715-11720.
图2 大规模的反刍动物基因组测序为研究反刍动物的进化和特性提供了新的思路基于三代测序的群体基因组De novo研究也如火如荼，美国约翰霍普金斯大学、冷泉港实验室和其他机构的研究人员使用Oxford Nanopore长读长技术的高通量PromethION测序平台，在100天内对100个番茄品种完成测序。研究者结合使用长读长技术、计算生物学和功能研究来发掘和鉴定番茄的结构变异，以便在未来进行从自然变异和驯化到作物改良的一系列研究。该团队同时采用了比对检测和从头组装两种策略进行结构变异分析，2019年5月7日，Nature Plants杂志在线发表了该研究的部分成果[3]。
